1、DNA 片段的扩增PCR 技术 【教学目标】 （一）认知目标 1、了解 PCR 技术的基本操作步骤。 2、理解 PCR 的原理。 3、讨论 PCR 技术在生产生活中的应用。 （二）能力目标 1、通过多聚酶链式反应扩增 DNA 片段，锻炼学生实际动手能力。 2、通过严格控制温度等反应条件，培养周密的思维能力。 （三）情感、态度与价值观目标 1、 通过对 PCR 实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研 精神。 2、 通过对生物高新技术的接触，加深学生对实验科学的热爱。 【课题重点】 PCR 的原理和 PCR 的基本操作。 【课题难点】 PCR 的原理 【教学方法】 启发式教学
2、 【教学工具】 多媒体课件 【教学过程】 （一）引入新课 上课之初先在视频上播放一段中央 12 套天网节目，截取其中法医提取毛发，提取 DNA 进行与嫌疑人比对的片段。（从学生熟悉的节目场景入手，激发他们心中疑惑已久的 探知兴趣）。 师：法医提取的毛发里面的 DNA 量是比较少的，要进行比对需要大量的 DNA 样品， 也就是在比对之间是不是需要先对 DNA 进行扩增？这就是咱们今天要学习的科技尖端的 PCR 技术，即：聚合酶链式反应，简称 PCR（英文全称： Polymerase Chain Reaction）。 等学完本课你们要告诉我 PCR 技术还能应用与什么领域？ （二）新课教学 1基础
3、知识 PCR 技术扩增 DNA 的过程，与细胞内 DNA 复制过程类似： 11 细胞内 DNA 复制条件分析：（引导学生思考需要的条件，师生共同完成下表） 条件 组分 作用 模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料 酶 解旋酶 DNA 聚合酶 打开 DNA 双螺旋 催化合成 DNA 子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点 12 简单复习 DNA 复制过程 解 旋：解旋酶、ATP，DNA 两条链打开，形成两条 DNA 单链。 引物结合：在 DNA 单链 3端与 DNA 反向配对结合，确保引物
4、 3端与 DNA 单链准确配 对。 DNA 聚合酶结合。 子链合成：DNA 聚合酶从引物 3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：DNA 聚合酶 I 将引物切去，并合成空缺处的 DNA 单链，再由 DNA 连接酶将不 连续的 DNA 子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“53合成”。 1.3 DNA 分子复制的人工控制 根据 DNA 复制的条件，我们能不能在体外模仿 DNA 的复制，进行体外扩增呢？教师 引导学生归纳 DNA 体外扩增需要的条件： 解开螺旋：在 80100时，DNA 双螺旋打开，形成两条 DNA 单链，称为变性。 思考：
5、为何不需要解旋酶？在生物体内的温和条件下就能使 DNA 的双链解成单链。在 没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使 DNA 分子活化，当在体外加热 到 90oC95 oC，DNA 分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以 PCR 技术扩增 目的基因不需要解旋酶。 恢复螺旋：在 50左右时，两条 DNA 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA 模板,四种脱氧核苷酸,热稳定 DNA 聚合酶,两种引物。 思考：引物的作用是什么？ DNA 的复制都需要引物，在体内复制时，先由 RNA 聚合酶在 DNA 的模板上合成一段 RNA 引物，再由 DNA 聚合酶从
6、RNA3端开始合成新的 DNA 链，产物片段的长度严格地限定 在两个引 物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。（根据 PCR 原理图示帮助理解） 反应场所：PCR 仪。 思考缓冲液相当细胞内的什么成分？ 4PCR 的反应过程 变性 复性 延伸 变性：在 95时 DNA 解旋 复性：在 50时引物与 DNA 单链结合 延伸：在 72时合成 DNA 子链（两个引物间的序列） 思考：为什么延伸温度为 72？ Taq 酶在 72左右才有最佳的活性。 思考：一般进行多少个循环？共有多少条 PCR 产物？ 25-30 个循环最佳，过少产物量不够，过多原料、能量等消耗殆尽。产物为 225-230。 展示 P
7、CR 原理示意图，梳理清晰： 2实验操作 2.1 PCR 反应体系：缓冲液、 DNA 模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定 DNA 聚合酶、 两种 RNA 引物，水 2.2 实验操作步骤 2.3 按照 PCR 反应体系配方配制反应液； （2）将 PCR 反应体系 50L 用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （3）将微量离心管放到 PCR 仪中； （4）设置 PCR 仪的工作参数。 （5）DNA 在 PCR 仪中大量扩增。 3实验注意事项 3.1 避免外源 DNA 污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 3.2 缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。 3.3 每添加一种反应成分，
8、更换一个移液器的枪头。 3.4 混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 4结果分析与评价 4.1 反应液稀释：取 2LPCR 反应液，添加 98L 蒸馏水； 2分光光度计调零：将 100L 蒸馏水添加到比色杯中，在 260nm 处将分光光度计调整读数为零。 4.2 将 100L 反应稀释液倒入比色杯中，测定在 260nm 处的光吸收值。 4.3 计算：DNA 含量50光吸收值稀释倍数 （三）课堂总结、点评 （四）实例探究 例 1 在（ ）的温度范围内，DNA 的双螺旋结构解开 A. 1020 B. 80100 C. 2030 D. 4060 解析：蛋白质大多不能忍受 6080的高温，而 D
9、NA 在 80以上才会变性。 答案：B 例 2 关于 DNA 的复制，下列叙述正确的是（ ） A. DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 5端延伸 DNA 链 B. DNA 复制不需要引物 C. 引物与 DNA 母链通过碱基互补配对进行结合 D. DNA 的合成方向总是从子链的 3端向 5端延伸 解析：由于 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从引物的 3端即复制方向由 3 端向 5端延伸；由于 DNA 分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在 DNA 聚 合酶作用下合成的，其合成方向是从子链 5端向 3端延伸。 答案：C 例 3 下列有关 PCR 描述，不正确的是（
10、 ） A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增产量按 y（1X）n D. 扩增对象是氨基酸序列 E. 扩增对象是 DNA 序列 解析：PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，它以极少量的 DNA 为模板，以四种 脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使 DNA 聚合酶从引物的 3端连接脱氧核苷酸，短时 间内迅速复制上百万份的 DNA 拷贝，其扩增产量为 y（1X）n，y 代表 DNA 片段扩增后 的拷贝数，x 表示平均每次的扩增效率，n 代表循环次数，因此答案选 D。 答案：D 【作业】 1、PCR 与生物体 DNA 复制有何区别？ 2、举例说明 PCR 技术在生活中的应用？
