1、第四章 生物化学与分子生物学技术实践 4.1 生物成分的分离与测定技术（蛋白质的分离与纯化） 探究目的： 1、体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法 2、了解电泳法分离生物大分子的基本原理 探究预习： 实验操作程序 (1)样品处理 红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； 血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来； 分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。 (2)粗分离 原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内，透析可以除去样品中分子质量较小的杂质。 过程：取 1 mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析
2、袋放入盛有 300 mL 的物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液中(pH 为 7.0)，透析 12 h。 目的： 图示： 注意：透析时间为 12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可 自由进出，而大分子保留在袋内。 (3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴 定。 3结果分析与评价 【解读步骤】 (1)红细胞的洗涤 采集血样低速短时间离心吸取血浆盐水洗涤低速离心重复步骤三次。 特别提醒 (1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。 (2)离心时转速要低，
3、时间要短，一般为 500 r/min，离心 2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。 (2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加 40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充 分搅拌 10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2 000 r/min 的速度离心 10 min 后，试管中的溶液分为 4 层： 第 1 层（最上层）：甲苯层（无色透明） 第 2 层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体） 第 3 层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体
4、） 第 4 层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色） 特别提醒 (1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。 (2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。 (4)透析 取 1 mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300 mL 的物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸 缓冲液中(pH 为 7.0)，透析 12 h。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。 2凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 取长 40 cm，内径为 1.6 cm 的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用 100 目尼龙纱包好。 顶塞的制作：打
5、孔安装玻璃管。 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。 特别提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白 质分离不彻底。 (2)凝胶色谱柱的装填( 本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶) 固定：将色谱柱垂直固定在支架上 装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内 洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶 12 h (3)样品的加入和洗脱 调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用量为 1 mL 样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层 洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 5
6、 mL 收集一管，连续收集 特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成功。 材料用具：猪、牛、羊或者其他脊椎动物的血液，离心管，透析袋，凝胶色谱柱，聚 丙烯酰胺凝胶电泳的装置等。 探究过程（）： 探究步骤 探究记录 结论或解 释 1.配制试剂 选择相应的化学试剂，配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。 配制巴比妥缓冲液（pH 8.6）1 000 mL（巴比妥 2.76 g， ，巴比妥钠 15.45 g，加蒸馏水定容至 1000 mL）
7、；配制染色液 100 mL（氨基黑 l0B 0.25 g，甲醇 50 mL，冰醋酸 10 mL，蒸馏水 40 mL） ；配制漂洗液 100 mL（甲醇或乙醇 45 mL，冰醋酸 5 mL，蒸馏水 50 mL） ；配制透明液 100 mL（无水乙醇:冰醋酸=7:3 ） 。 2.架滤纸桥 按照支架的大小裁剪合适的滤纸条，取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐， 另一端浸入电泳槽的缓冲液，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于 支架上，即是滤纸桥。 3.浸泡薄膜 用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡 20 min。 4.细心点样 取出薄膜，吸去多余
8、的液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下。点样 时用盖玻片在血清中蘸一下，在离薄膜一端 23 cm 处轻轻按下，随即提 起。 5.平悬薄膜 用镊子夹取薄膜将点样端平贴在电泳槽负极支架的“滤纸桥”上，有记号的一面朝上，另一端平贴于正极，呈绷直状态。 6.实施电泳 盖上电泳槽盖，在薄膜平衡约 10 min 后通上电源，电压调至 160 V，每厘米膜宽电流强度 0.40.8 mA，电泳时间 6090 min。 7.染色 电泳完毕后切断电泳仪电源，取下薄膜，放入染色液中浸泡 510 min。 8.漂洗 从染色液中取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净为止，即可得到色带清晰的电泳图谱。 9.
9、脱色 用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入透明液中约 5 min，取出后平贴于玻璃板上，待完全干燥后便成透明膜，可长期保存。 探究反思： 1简述蛋白质分离的方法及原理。 2.在蛋白质的提取和分离（如洗脱等）中通常要用缓冲液，什么是缓冲液？它有什么作用？ 探究示例： 红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能 是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提 取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：_、_、_和_。 （2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行
10、 离心，收集血红蛋白溶液。 加入柠檬酸钠的目的是_。该过程即样品处理，它包括_、_、收集血红蛋 白溶液。 （3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。 透析的目的是_。 透析的原理是_。 （4）通过凝胶色谱法将样品进一步纯化 (如下图)，在操作中加样的正确顺序是_， 最后经 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 样品纯化的目的是_。 血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意_。 【答案】 （1）样品处理；粗分离；纯化；纯度鉴定 （2）防止血液凝固红细胞的洗涤，血红蛋白的释放 （3）去除分子质量较小的杂质透析袋能使小分子自由进 出，而大分子则保留在袋内
11、 （4） 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂 质蛋白除去血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以 通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简 化了实验操作。 【矫正反馈】 1.关于电泳概念的理解，错误的是 （ ） A能进行电泳的物质一般是带电颗粒 B带电颗粒向着与其电性相同的电极移动 C影响电泳速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强度、溶液的 pH 等 D电泳支持物有滤纸、大分子凝胶、醋酸纤维薄膜等 2关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是 （ ） A分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来 B抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂 C蛋白质的粗提
12、取物离心可除去一些小分子杂质 D蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物 3有关透析的叙述中，错误的是 （ ） A用于透析的薄膜要具有选择透过性 B透析膜一般是由硝酸纤维素 制成的 C透析能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内 D透析可用于更换样品的缓冲 液 4下列关于离心沉降的说法中，不正确的是 （ ） A目标不同，需要控制不同的离心速率 B能将分子大小、密度不同的蛋白质分离 C离心时，离心管内的溶液量要相同，但不需要对称放置在离心机内 D离心后，分子大小、形状不同的蛋白质会分布在不同的沉降层中 5带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于 （ ） A所带的电荷多少 B蛋白质的分子大小 C蛋
13、白质相对分子质量 D蛋白质的分子大小和所带的电荷多少 6下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是 （ ） A加滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上 B浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号 C平悬薄膜时，有记号的一面朝上 D从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色 7下列关于“DNA 和血红蛋白的提取与分离”实验的叙述，不正确的是（ ） A提取动物细胞中的 DNA 和蛋白质都可以采用蒸馏水胀破细胞的方法 B采用不同浓度的 NaCl 溶液反复溶解与析出 DNA 的方法可去除蛋白质等杂质 C蛋白质纯化过程中采用透析法可去除溶液中的小分子杂质 D血
14、红蛋白只能采用凝胶色谱法纯化， DNA 则可采用电泳、盐析等方法纯化 8下列关于蛋白质的纯化方法的叙述，错误的是 （ ） A纯化主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的 B透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同 C通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋 白质 D不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质 9用凝胶色谱法分离蛋白质的实验中，相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶中的行进过 程，可表示为图中哪一个( ) 10在 pH5.12 时进行电泳，哪种蛋白质既不向正极移动也不向负极移动 ( ) A
15、血红蛋白：pI(等电点)7.07 B鱼精蛋白：pI12.20 C 1球蛋白：pI5.06 D 球蛋白： pI5.12 【迁移应用】 1.下列叙述中错误的是 （ ） A改变 NaCl 溶液的浓度只能使 DNA 溶解而不能使其析出 B在沸水浴中，DNA 遇二苯胺试剂会呈现 蓝色 C用电泳法可分离带电性质、分子大小和形状不同的蛋白质 D用透析法可去除蛋白质样品中的小分子 物质 2科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。该蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究 者重视。 （1）分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子 的 、大小及形 状不同，在电场中的 不同而实现分离。 （2）可用金黄色葡萄球菌来
16、检验该蛋白的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏 和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。 （3）分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两 种培养基中菌落的 ，确定该蛋白质的抗菌效果。 （4）细菌培养常用的接种方法有 和 。实验结束后，对使用过的 培养基应进行 处理。 3.下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图)和洗脱(图)示意图，请据图回答 下列问题 、 (1)在加样示意图中，正确的加样顺序是_。 (2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是_、 _、_。 (3)等样品_时，才加入缓冲液。 (4)待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液每_mL 收集一管，连续收集。 4如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列 问题。(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在 红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。 (2)甲装置中，B 是血红蛋白溶液，则 A 是_；乙装置中， C 溶液的作用是_。 (3)甲装置用于_，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫 _，是根据_分离蛋白质的有效方法。 (4)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每 5 mL 收集 一管，连续收集。
