1、本科毕业论文1,3二氯丙烯熏蒸剂对土壤细菌微生物多样性的影响13TWOALLYLCHLORIDEFUMIGANTEFFECTONSOILBACTERIAMICROBIALDIVERSITY系（院）名称太原师范学院学院专业班级10级生物科学学生姓名学号2010131126指导教师姓名指导教师职称教授2014年5月目录中文摘要1英文摘要2引言2第一章材料和方法311实验材料312研究方法3123变性梯度凝胶电泳（DGGE）3DGGE凝胶系统是由变性胶和上层胶组成的，具体配方见表213123116SRDNAV3片段的PCR扩增41232切胶回收4123316SRDNAV3片段的二次PCR及产物回收4
2、1234细菌16SRDNAV3片段的克隆测序5124DGGE图谱分析方法6127系统发育分析方法6第二章结果与分析621土壤微生物总DNA的提取622土壤样品基因组DNA的PCR扩增723微生物的DGGE凝胶图谱的分析及比较725相似性聚类分析9图25相似性聚类分析图9第三章讨论与结论10致谢11113二氯丙烯熏蒸剂对土壤细菌微生物多样性的影响姓名指导教师摘要为了研究1,3二氯丙烯土壤熏蒸剂处理对土壤微生物细菌的多样性的影响。在温室大棚以13二氯丙烯混合式（27G/M2）、13二氯丙烯顺式（27G/M2）、13二氯丙烯反式（27G/M2）、溴甲烷（50G/M2）、对照的浓度采用覆膜熏蒸法熏蒸。
3、收集土壤并提取土壤微生物的DNA。PCR扩增后，采用DGGE图谱分析方法测定土壤微生物细菌多样性。结果表明4种熏蒸剂对土壤进行处理后，总体上看土壤当中的多样性、均匀度、丰富度都有减小的趋势，但是在每一项当中又有例外，用13二氯丙烯反式（27G/M2）处理多样性没有减小反而略有增加。，用溴甲烷（50G/M2）均匀度反而增大，13二氯丙烯反式（27G/M2）处理过的土壤样品微生物细菌丰富度增大没有减小。在相似性聚类分析中可以看出，5个样品中，细菌微生物群落多样性的相似性程度并不高，其中3号样品和5号样品的相似度最高但也只有62左右。结论是什么、关键词1,3二氯丙烯；土壤微生物；多样性；13TWOA
4、LLYLCHLORIDEFUMIGANTEFFECTONSOILBACTERIAMICROBIALDIVERSITYABSTRACTINORDERTOSTUDYTHE1,3DICHLOROPROPYLENESOILFUMIGANTSTREATMENTONTHEINFLUENCEOFTHEDIVERSITYOFSOILMICROBIALBACTERIADONTINGREENHOUSESWITH13TWOALLYLCHLORIDEHYBRID27G/M2,13ALLYLCHLORIDECIS27G/M2,13ALLYLCHLORIDETRANS27G/M2,METHYLBROMIDE50G/M2,
5、THECONCENTRATIONOFTHECONTRASTEFFECTOFFUMIGATIONMETHODISUSEDTOFUMIGATIONCOLLECTSOILANDEXTRACTTHESOILMICROBIALDNAAFTERTHEPCRAMPLIFICATION,USINGDGGESPECTRUMANALYSISMETHODFORDETERMININGSOILMICROBIALDIVERSITYTHERESULTSSHOWEDTHATTHEFOURKINDSOFSOILFUMIGANTSONAFTERPROCESSING,THEOVERALLDIVERSITY,EVENNESSANDR
6、ICHNESSOFTHESOILHASADECREASINGTREND,BUTINTHEMIDDLEOFEACHANDTHEREAREEXCEPTIONS,DIVERSITY,3SAMPLESWITH13TWOALLYLCHLORIDETRANS27G/M2PROCESSINGISANEXCEPTION,DIVERSITY,INSTEADOFBEINGDECREASEDSLIGHTLYINCREASEDEVENNESS,WITH4METHYLBROMIDE50G/M2PROCESSINGISANEXCEPTION,DIDNOTDECREASEINSTEADOFINCREASE,RICHNESS
7、,3SAMPLESWITH13TWOALLYLCHLORIDETRANS27G/M2TREATEDSOILSAMPLESOFMICROBIALBACTERIAABUNDANCEINCREASEDIDNTDECREASEINSIMILARITYCANBESEENINTHECLUSTERINGANALYSIS,FIVESAMPLES,BACTERIAMICROBIALCOMMUNITYDIVERSITYOFSIMILARITYDEGREEISNOTHIGH,AMONGTHEM3SAMPLESAND5SAMPLESOFTHEHIGHESTSIMILARITYBUTALSOONLYABOUT62KEY
8、WORDS1,3DICHLOROPROPYLENESOILMICROBESDIVERSITY2引言1,3D作为土壤熏蒸杀线虫剂，主要用于蔬菜、苗木、观赏性园艺作物、果树、草莓和葡萄等高投入、高产值作物种植前土壤消毒处理，对于多种土传病虫害具有很好的防治效果，但对于一些土传病原菌的厚垣孢子、菌核以及杂草的休眠种子活性较差（DUNIWAY，2002；ZASADA等，2010）1。参考文献上标是从1开始的，不是从15。请下边的参考文献上标号按顺序排列、国内外研究者对1,3D的应用展开了多方面的研究。国内方面，范昆等采用盆栽和田间试验研究了1,3D对番茄根结线虫病的防治效果（范昆等，2006B）。结果
9、表明各剂量1,3D熏蒸处理土壤均能显著减轻番茄根结线虫病的为害，刺激番茄生长。宋兆欣等采用室内生物测定及田间试验测定1,3D对土传病原菌和根结线虫的生物活性及田间应用效果，探索1,3D为甲基溴替代品的可行性（宋兆欣，2008）。结果表明，1,3D能够有效防治根结线虫和土传病原菌，而且对黄瓜、番茄有明显的增产效果。颜冬冬等通过室内培养的方法，以北京黄瓜和番茄大棚轮作地土壤为对象，研究1,3D对土壤氮素转化的影响（颜冬冬等，2010）7。结果表明，1,3D处理后能显著增加土壤中NH4N累积量，而在后期培养过程中，各处理矿化作用和硝化作用都逐渐恢复至对照水平。国外方面，KLOSE等人研究了杂草种子和
10、土传病原物对1,3D氯化苦（INLINE）的剂量响应关系（KLOSE等，2007）。结果表明，在杂草中，马齿苋的种子是对INLINE最为敏感，其次是繁缕和蓼属植物，小花锦葵和牻牛儿苗的种子对INLINE不敏感；在所有的病原菌中，腐霉最敏感而黄萎病菌最不敏感，辣椒疫霉和枯萎病菌表现出中等程度的敏感性。SANTOS等人进行大田试验明确了1,3D氯化苦在鲜食番茄上与甲基溴相比在控制线虫、土传病害和杂草的效果（SANTOS等，2006）8。结果表明，1,3D氯化苦与敌草胺氯吡嘧磺隆或是甲氧毒草胺或是三氟啶磺隆混用，其效率与甲基溴氯化苦相当，并且在两个生长季节1,3D氯化苦在VIF下始终与甲基溴氯化苦效
11、果相当。GILREATH等进行田间试验来对照不同的除草剂与1,3D氯化苦（C17）混用对莎草的控制作用和它们对番茄和辣椒的产量效果（GILREATH等，2004）。结果表明，虽然C17能减少了莎草的密度，但是只依靠熏蒸剂不足以避免番茄产量损失。因此，有必要将熏蒸剂与除草剂混用来增强对莎草的控制效果。KLOSE等研究了甲基溴替代物1,3D、溴丙炔、甲基碘和氯化苦熏蒸土壤后对于土壤酶的影响（KLOSE等，2004）。结果表明，土壤施用甲基溴替代物后具有改变土壤微生物群落的潜力，并在营养转化过程中发挥重要作用。DUNGAN等人研究了经1,3D和溴丙炔熏蒸处理过的土壤的微生物群落变化情况（DUNGAN
12、等，2003）。结果表明可以通过向土壤中添加有机质来减少熏蒸剂对于土壤微生物群落的影响914。31材料和方法11实验材料供试土壤供试土壤为北京市密云县黄瓜大棚轮作3年以上土壤。土壤为沙壤土，其理化性质为有机质3255GKG，铵态氮6991MGKG，硝态氮24876MGKG，速效钾43931MG/KG，有效磷66077MG/KG，PH685。表11土壤理化性质分析有机质铵态氮硝态氮速效钾有效磷PH255GKG6991MGKG24876MGKG43931MG/KG66077MG/KG685111药品1,3二氯丙烯1,32DICHLOROPROPENE97原油山东淄博鲁达化工有限公司。12研究方法1
13、21土壤的处理试验地前茬为番茄，于2010年11月2日分别在温室大棚以13二氯丙烯混合式（27G/M2）、13二氯丙烯顺式（27G/M2）、13二氯丙烯反式（27G/M2）、溴甲烷（50G/M2）、溴甲烷（30G/M2）、对照的浓度采用覆膜熏蒸法熏蒸，半个月揭取PE膜，定值黄瓜苗。在黄瓜生长期未施用化学肥料。土壤样品采样时间为2011年10月22日，采用对角线取样法取三个大棚515CM土壤样品，混合后保存于20和80各一份备用。122土壤总DNA的提取与检测土壤总DNA的提取按照MOBIO公司生产的土壤DNA提取试剂盒步骤提取。DNA提取物用2胶浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。每个处理样品3个重复，
14、然后混合DNA提取液，保存于20冰箱中备用。123变性梯度凝胶电泳（DGGE）DGGE凝胶系统是由变性胶和上层胶组成的，具体配方见表21表12变性梯度凝胶的配方TABLE21DENATUREDGRADIENTGELFORMULA试剂变性胶浓度上层胶浓度3550840ACRYL/BISSOLUTION20ML20ML1ML50XTAEBUFFER2ML2ML100LFORMAMIDEDEIONIZED14ML20MLUREA147G21GDDH2O补至100ML100ML5ML10AMMONIUMPERSULFATE20L20L10L4TEMED160L160L80L操作步骤1将海绵胶条固定在制
15、胶架上,把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵胶条上方用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统。2在两个注射器上分别标记“高”与“低”。3逆时针方向旋转凸轮到传送体积的起始位置，固定体积调整旋钮。调整梯度传送系统的刻度到125ML。4取表21配制好的变性胶各125ML，分别加入10的AMMONIUMPERSULFATE20L和TEMED160L,混匀后迅速用标记高的注射器将50的变性胶吸入注射器以及标记低的注射器将35的变性胶吸入注射器，推动注射器排除体系空气,并安装上相关的配件。5匀速旋转凸轮进行灌胶，完成后注入1ML无菌水，静置凝固约45MIN，小心倾倒出上层无菌水，用滤纸小心拭去
16、制胶板上水珠，迅速注入上层胶5ML（加入10的AMMONIUMPERSULFATE10L和TEMED80L）。6小心插入梳子，在电泳前至少60MIN打开开关，以便电泳缓冲液在60达到平衡。7待电泳缓冲液温度升至60,关掉开关，打开盖子，待凝胶聚合完成后，拔出梳子，清洗加样孔，将胶板系统放入电泳槽内。8PCR产物5L和LOADINGBUFFERS5L,混合后注射针上样,盖上盖子，打开开关。9打开电源，电泳200V35H。10电泳完毕后，用镊子敲开一侧玻璃板，将胶置于染色盘中，用1XTAEBUFFER轻轻冲洗摇动，使胶与玻璃板脱离。11将胶置于盛有LXTAEBUFFER的染色盘中，待染色。12将稀
17、释10000倍的SYBRGREENI约25ML倒入染色盘中置于摇床上染色45MIN后，在BIORAD公司的凝胶成像系统进行拍照并分析染色。123PCR反应程序123116SRDNAV3片段的PCR扩增设计细菌的16SRDNA序列V3片段扩增的通用引物。引物选用341FGC（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）和534R（ATTACCGCGGCTGCTGG），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系PCRMASTERMIX125L，每种引物1L（10PMOL1），15L的发酵蔬菜总DNA，加DDH2O至终体积
18、25L。反应程序94预变性5MIN，9430S，48830S，7245S，728MIN,35个循环,最后于4恒定保存。取PCR产物各5L，10琼脂糖凝胶电泳检测，BIORAD公司凝胶成像系统观察。1232切胶回收用无菌手术刀将DGGE凝胶上的特征条带切下并置于无菌PCR管中，用无菌枪头将回收条带胶条碾碎，加约40L去离子水于PCR管中4过夜。123316SRDNAV3片段的二次PCR及产物回收引物341F（CCTACGGGAGGCAGCAG），534R（ATTACCGCGGCTGCTGG），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系PCRMASTERMIX125L，每种引物1L（10PM
19、OL1），取235的产物15L为模板，加DDH2O至终体积25L。PCR反应程序同2335PCR产物于10琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，操作步骤参见大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。1234细菌16SRDNAV3片段的克隆测序1235纯化PCR产物的连接经纯化后的PCR产物（即236的产物）与PGMTVECTOR进行连接，连接反应体系参照PGMT克隆试剂盒操作说明如下表13连接的反应体系TABLE22REACTIONSYSTERMOFLINKAGE试剂加样量目的PCR片段6LPGMTVECTOR50NG/L1L10XT4DNALIGATIONBUFFER1LT4DNALIGASE1LDDH
20、2O补足到10L混匀后，16过夜。1236转化在超净台内将10L连接产物加入到装有90L感受态细胞的15ML离心管中，轻轻混匀，冰上静置30MIN，42热击90S，迅速静置于冰上23MIN，加入250500L的LB不含抗生素液体培养基，混匀，37150R/MIN振荡培养45MIN，将100L已转化的感受态细胞涂布于含氨青霉素100L/MLIPTG和XGAL的LB平板上，于37倒置过夜培养。1237检测（1）快速检测操作步骤参照重组菌落PCR鉴定试剂盒如下1按以下体系配好含有引物的TAQMASTERMIX反应液。表14反应体系TABLE23REACTIONSYSTERM试剂加样量T7PRIMER
21、10M1LT3PRIMER10M1L2XTAQMASTERMIX10LDDH2O8L2将过夜培养的平板上的菌落编号后，使用灭菌的牙签挑取一部分单菌落加入上述反应液，剧烈振荡使菌落充分分散到反应液中。3短暂离心收集管中的液体后，进行PCR反应。4PCR反应循环的设置94预变性3MIN，9430S，5530S，72051MIN，725MIN，30个循环。5结果检测反应结束后取5L反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。（2）常规检测将得到的白色菌落接种15MLLB（含有终浓度50100G/ML的氨苄青霉素）培养基，37摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，鉴定插入片段是否正确。提取质粒时按照质粒小提试剂盒操
22、作说明书TIANGEN进行。61238测序在超净工作台用灭菌枪头挑取经检测为阳性的白色菌落于已装有1ML灭菌的液体LB（含氨苄青霉素）培养基的2ML离心管中，150RPM振荡，37温育2H，菌液混浊后，送至华大基因进行测序。124DGGE图谱分析方法DGGE指纹图谱分析借助于BIORAD公司的凝胶成像系统进行条带判读，并用QUANTITYONESOFTWARE进行分析。125DGGE条带结构多样性分析使用QUANTITYONE软件进行DGGE条带分析，每个条带的位置和相对光密度值被该软件自动分析确定。为了最大程度的降低DGGE过程中不同样品间DNA上样浓度的差异，每个条带的光密度峰值除以该条带
23、所在泳道所有条带光密度峰值的平均值进行数据的标准化处理。每条泳道内的条带数量用以评价物种丰富度SPECIESRICHNESS，并通过条带相对密度值计算物种均匀度SPECIESEVENNESS及物种多样性（SHANNON）6。多样性指数（H）、均匀度指数（E）及丰富度指数（R）的计算公式HNI/NINNI/N（21）EH/INS22RS1/INN23式中，NI为单一条带的峰面积，N为某一泳道所有峰面积，S为某一泳道的总条带数。126相似性聚类分析使用QUANTITYONE软件的UWPGAUNWEIGHTEDPAIRGROUPMETHODUSINGARITHMETICAVERAGES方法对DGGE
24、图谱进行相似性聚类分析“127系统发育分析方法对测序结果进行去载体，目的片段的筛选，将得到的目的片段序列提交到GENBANK中进行BLAST比对，获得与目的片段相似度高的序列，通过MEGA40利用NEIGHBORJOINING法建立16SRDNA的的系统发育树，对其进行系统发育分析6。2结果与分析21土壤微生物总DNA的提取土壤总DNA的提取按照MOBIO公司生产的土壤DNA提取试剂盒步骤提取。将土壤样品提取所得的DNA进行1的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图21。从图中电泳结果可见，各个土壤样品获得的土壤微生物基因组总DNA条带清晰可见，纯度较高，符合DGGE分析的DNA质量要求1。图21土壤总
25、DNA琼脂糖凝胶电泳图722土壤样品基因组DNA的PCR扩增设计细菌的16SRDNA序列V3片段扩增的通用引物。引物选用341FGC（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）和534R（ATTACCGCGGCTGCTGG），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。由于土壤中含有大量的腐殖质成分，在提取纯化过程中无法完全除去。如果直接以提取的总DNA作为模板进行扩增，扩增效率较低，无法满足下一步的DGGE分析，本试验采用稀释模板和利用巢氏PCR（NESTPCR）进行扩增的方法加以解决。用稀释（土壤总DNA稀释50倍，可培
26、养细菌总DNA稀释100倍）过的总DNA作为模板以341F（CCTACGGGAGGCAGCAG）和534R（ATTACCGCGGCTGCTGG）为引物扩增出条带后，再以其为模板，以341FGC和534R为引物进行第2次PCR扩增，获得特异16SRDNAV3区扩增片段2。图22PCR扩增产物的电泳条带23微生物的DGGE凝胶图谱的分析及比较土样中直接提取DNA，通过PCR扩增16SRDNAV3区片段后，进行DGGE凝胶电泳，获得微生物的16SRDNAV3区DGGE凝胶图谱，利用QUANTITIYONE对图谱进行分析比较。图23DGGE电泳图谱DGGE模式图利用QUANTITYONEDGGE凝胶图
27、谱进行分析，结果见图45是以样品3为标准做出5个样品8的泳道识别图。泳道中的条带粗细不一，对应其在DGGE胶上的密度大小不同。密度大，则条带比较粗黑；密度小，则条带比较细。图中显示共有29类条带，1号、19号和20号、21号条带在每个样品中均出现，26号、28号条带出现在4个样本中，且1号、13号条带在每个泳道中都较粗。7号和14号条带也被视为比较特征的条带统计图中分离的条带数，从微生物DNA样品中共分离得到29条不同条带，说明5个土壤样品中共检测到29种不同的微生物DNA信息。不同样品间微生物种群丰富程度不同，各个采样点分离条带数占总条带数的比率为385611。其中3号样品的条带数最多，一共
28、有20条，5号样品次之，共有19条条带，1号样品14条条带，2号样品17条条带，4号16条条带。虽然微生物DNA样本来源于同一采样点原始土壤样品，但是5个样品的电泳图谱在电泳条带数、条带分布及条带显色亮度方面都有较大差异2425。24DGGE条带结构多样性分析表24熏蒸剂熏过的土壤样品中细菌微生物群落结构特征从结果的统计来看，土壤微生物的丰富度、均匀性和多样性均受到一定程度地影响。多样性总体来说是有减小的趋势，其中1号样品和4号样品减小的比较明显，1号样品减小的最为明显，说明13二氯丙烯混合式（27G/M2）对土壤的处理效果最为明显，对多样性的影响最大，3号样品是个例外，多样性没有减小反而略有
29、增加。在对均匀度的分析中我们可以看出，均匀度总体上有减小的趋势，但是其中的4号是一个例外，没有减小反而增大3，说明不同的熏蒸剂处理对于土壤中的微生物的均匀度的影响有很大的区别，溴甲烷（50G/M2）处理后，土壤中的微生物的均匀度增大，13二氯丙烯混合式（27G/M2）、13二氯丙烯顺式（27G/M2）、13二氯丙烯反式（27G/M2）处理后均匀度均减小，其中1号即用13二氯丙烯混合式（27G/M2）处理后均匀度减小的最为明显。对丰富度的分析中可以看出，总体上有减小的趋势，但是也有例外，3号样品即用13二氯丙烯反式（27G/M2）处理过的土壤样品微生物细菌丰富度增大，1号、2号、4号样品结果均减
30、小，其中4号样品即溴甲样品SHANNON指数H均匀度E丰富度R138829331234674209031624051107127471323903923454281944399552442336491285018135697313321512790801189051623905729烷（50G/M2）处理过的土壤中微生物细菌的丰富度减小的最为明显4。25相似性聚类分析图25相似性聚类分析图聚类分析树状图对样品间的差异进行比较，从聚类的结果来看，样品1和2在同一支上，他们的相似性程度为57左右，样品3和5在同一支上，他们的相似性程度为62左右，4号样品独立为一支，说明它与其他样品的相似性不高，样
31、品4和样品3、5的相似性程度为43左右，样品1和2与样品3、4、5的相似性程度也不高，只有40左右，从以上的结果可以发现，5个样品中微生物细菌的相似性程度不高。说明不同熏蒸剂处理土壤后，土壤中微生物群落结构差异很大5。26系统发育树分析图26系统进化树图对测序结果进行去载体，目的片段的筛选，将得到的目的片段序列提交到GENBANK中进行BLAST比对，获得与目的片段相似度高的序列，通过MEGA40利用NEIGHBORJOINING法建立16SRDNA的10的系统发育树，对其进行系统发育分析。如图可知，5个样品可分为3大家族，分别是，1号和4号和2、3、5号22。3讨论与结论通过对5种熏蒸剂熏蒸
32、土壤和直接从土壤样品中提取基因组DNA,以及后续的PCRDGGE分析,采用基于熏蒸和基于PCRDGGE以及系统进化树分析的联合方法测定的结果表明,熏蒸剂不同的土壤微生物多样性、均匀度、丰富度存在较大的差异16。4种熏蒸剂对土壤进行处理后，总体上看土壤当中的多样性、均匀度、丰富度都有减小的趋势，但是在每一项当中又有例外，多样性中，3号样品即用13二氯丙烯反式（27G/M2）处理是个例外，多样性没有减小反而略有增加。均匀度中，4号即用溴甲烷（50G/M2）处理是一个例外，没有减小反而增大，丰富度中，3号样品即用13二氯丙烯反式（27G/M2）处理过的土壤样品微生物细菌丰富度增大没有减小。在相似性聚
33、类分析中可以看出，5个样品中，细菌微生物群落多样性的相似性程度并不高，其中3号样品和5号样品的相似度最高但也只有62左右。综合分析，13二氯丙烯混合式（27G/M2）对于土壤中微生物细菌的多样性的影响最大，多样性、均匀度、丰富度减小的最多23。聚类分析的结果表明，5个样品中微生物细菌的群落相似性程度并不高，样品3和5在同一支上，他们的相似性程度最高为62左右。系统进化树的结果表明5个样品可分为3大家族，分别是，1号和4号和2、3、5号17。土壤微生物系统对于外界干扰是极其敏感的，能快速反映土壤受干扰的影响，因此土壤微生物的特性被作为一种表征土壤质量变化的重要指标。土壤微生物的多样性可看作土壤肥
34、力的指标，在维持自然界生态系统物质循环和平衡中起着重要作用。在本研究中，1,3二氯丙烯土壤熏蒸剂明显减少土壤微生物细菌的多样性、均匀度、丰富度。生物多样性能较快地反映土壤质量的变化过程，并揭示微生物的生态功能差异，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一1820。不经过培养,从土壤中直接抽提微生物的总DNA,由于避免了在培养过程中的筛选和富集作用,能够更直接地反映土壤中微生物多样性及种群分布情况。本方法应用于土壤微生物生态多样性研究,比传统培养过程更快也更准确,对于全面掌握微生物多样性变化具有重要意义21。11参考文献请把其中一篇英文参考文献的英文摘要翻译成中文。1蔡道基,江希流,蔡玉祺化学农药对
35、生态环境安全评价研究农村生态环境,1986,29132国家环保局化学农药环境安全评价试验准则农药科学与管理,1990,2153354493朱鲁生,王军,林爱军,等二甲戊乐灵的土壤微生物生态效应环境科学,2002,23388919崔淑华,王开运,洪营,等戊唑醇对土壤微生物数量和呼吸强度的影响农业环境科学学报,2005,24586586910郭正元,唐美珍,袁敏,等碘甲磺隆钠盐对土壤中几种生物学指标的影响农药学学报,2005,71889111李克斌,蔡喜运,刘维屏除草剂单用与混用对土壤微生物活性的影响,农业环境科学学报,2004,23239239612龙健,黄昌勇,滕应,等矿区重金属污染对土壤环境
36、质量微生物学指标的影响农业环境科学学报,2003,221606313陈华癸土壤微生物学上海上海科学技术出版社,197914DUNGAN,RS,YATES,SR,2003DEGRADATIONOFFUMIGANTPESTICIDES1,3DICHLOROPROPENE,METHYLISOTHIOCYANATE,CHLOROPICRIN,ANDMETHYLBROMIDEVADOSEZONEJOURNAL2,2792861215WANG,D,GAO,S,QIN,R,BROWNE,G,2010LATERALMOVEMENTOFSOILFUMIGANTS1,3DICHLOROPROPENEANDCHLO
37、ROPICRINFROMTREATEDAGRICULTURALFIELDSJENVIRONQUAL39,1800180616WANG,Q,TANG,J,WEI,S,WANG,F,YAN,D,MAO,L,GUO,M,CAO,A,20091,3DICHLOROPROPENEDISTRIBUTIONANDEMISSIONAFTERGELATINCAPSULEFORMULATIONAPPLICATIONJOURNALOFAGRICULTURALANDFOODCHEMISTRY58,36136517ZHENG,W,PAPIERNIK,SK,GUO,M,YATES,SR,2003COMPETITIVEDE
38、GRADATIONBETWEENTHEFUMIGANTSCHLOROPICRINAND1,3DICHLOROPROPENEINUNAMENDEDANDAMENDEDSOILSJENVIRONQUAL32,1735174218李永红,高玉葆土壤中单嘧磺隆对谷子生长及土壤微生物若干生化功能的影响农业环境科学学报,2004,23463363719褚海燕,朱建国,谢祖彬稀土元素镧对红壤脲酶、酸性磷酸酶活性的影响农业环境保护,2002,19419319520和文祥,蒋新,余贵芬杀虫双对土壤脲酶活性特征的影响土壤学报,2003,40575075521王金花,朱鲁生,王军除草剂阿特拉津对土壤脲酶活性的影响应
39、用生态学报,2003,14122281228522王建武,冯远娇,骆世明BT玉米秸秆分解对土壤酶活性和土壤肥力的影响应用生态学报,2005,16352452823褚海燕,朱建国,谢祖彬镧对太湖地区水稻土若干水解酶活性的影响稀土,2002,233414324辛承友,朱鲁生,王军,等阿特拉津对不同肥力土壤蔗糖酶活性的影响农业环境科学学报,2004,23347948325唐美珍,郭正元,袁敏碘甲磺隆钠盐对土壤中过氧化氢酶活性及呼吸作用的影响土壤,2005,374421425附录1DNA琼脂糖凝胶电泳图13附录2DGGE电泳图谱14致谢本文的完成首先要感谢我的母校太原师范学院学院，没有四年的学习和知识
40、的积累，我是不可能完成毕业论文的。本文是在导师教授的亲切关怀和悉心指导下在中国农科院植保研究所完成的，从论文选题、实验方案的设计到具体实施过程，无不浸注着他们的历历心血和无私关爱。谨此对燕老师表示深深的谢意首先感谢老师对我的信任及在学习和生活上给予体贴入微的关心和帮助，在大学四年年的学习期间老师不仅给我提供了便利的实验条件，也给我提供了无微不至的思想上的教导，同时在整个论文撰写过程中对我进行耐心而又细致的指导，再次感谢老师三年来对我无微不至的关心和帮助感谢给予的关心和帮助，让我顺利完成了毕业设计的任务，并在论文选题、论文实验和论文修改上给予了极大的指导和帮助。同时，渊博的知识、严谨的治学态度，求实创新的思维、孜孜不倦的科研精神、为人处世的大家风范都将是我做人、做事和学习的典范，是我受益终身的宝贵财富。感谢太原师范学院，感谢她为我提供了一个宽松愉快的科研环境；尤其感谢赵文婧老师在我实习期间给予的关怀和指导，感谢各位老师在我实验过程中给予的方便和帮助。感谢中棉所所有给予我帮助和关心的老师和朋友最后，特别感谢我的父母和家人，感谢你们一直在背后默默的关心我、支持我，使我的学业得以顺利完成尤其感谢我的父母这么多年的养育之恩，是你们的教育和引导，使我勇敢、乐观的面对生活，在即将踏入人生另一个征程之际，衷心祝愿父母幸福安康15
