1、专题 5 课题 1 DNA 的粗提取与鉴定 一、基础知识 （一）提取 DNA 的方法 提取生物大分子的基本思路是选用一定的 或 方法分离具有不同物理或化学性质 的生物大分子。对于 DNA 的粗提取而言，就是要利用 DNA 与 RNA、蛋白质和脂质等在 和 性质方面的差异，提取 ，去除其他成分。 （1）DNA 的溶解性： （1）DNA 的溶解性： DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同，利用这一特点，选 择适当的盐浓度就能使 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目 的。 此外，DNA 不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于 酒精。利用这一原理， 可以将 DNA 与蛋 白
2、质进一步的分离。 （2）DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性： 蛋白酶能水解 ，但是对 DNA 影响。大多数蛋白质不能忍受 6080oC 的高 温，而 DNA 在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但 对 DNA 影响。 （二）DNA 的鉴定 在 条件下，DNA 遇 会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂。 二、实验设计 （一）实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织，成功的 可能性更大。 （二）破碎细胞，获取含 DNA 的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用 玻璃棒 ，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细
3、胞，需要先用 溶解 细胞膜。例如，提取洋葱的 DNA 时，在切碎的洋葱中加入一定的 和 ，进 行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。 （三）去除滤液中的杂质 方案一 利用 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中 的不同，通过控制 NaCl 溶液的浓 度去除杂质。 方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉，反应 1015min，嫩肉粉中的 能够分解 蛋白质。 方案三 将滤液放在 的恒温水浴箱保温 1015min，注意 范 围 。 （四）DNA 的 析出与鉴定 1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积 、 的酒精溶液（体积分数为 ） ， 静置 min，溶液中会出现 ，这就是粗提取的 DNA。用玻璃棒 搅拌，卷
4、起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。 2、取两支 20ml 的试管，各加入物质的量浓度为 的 NaCl 溶液 5ml，将丝状物放 入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入 4ml 的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热 5min，待试管 后，比较两支试管溶液颜色 的变化，看看溶解有 DNA 的溶液是否变 。 实例：用鸡血细胞液粗提取 DNA 并鉴定（苏教版必修 2） 步骤 操作 图示 1、提取鸡 血细胞的细 胞核物质 将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）510mL，注入到 50ml 烧杯中。向烧杯中加入 20mL，同时用玻璃棒沿一个 方向快速搅拌 5min，然后，
5、用放有纱布的 漏斗将血细胞过滤至 1000mL 的烧杯中，取其滤液。 2、溶解细 胞核内的 DNA 将物质的量浓度为 40 mL 加入到滤液中，并作玻 璃棒沿一个方向搅拌 1min，使其混合均匀，这时 DNA 在溶液中 呈溶解状态。 3、析出含 DNA 的粘稠 物 沿烧杯内壁缓缓加入 ，同时用玻璃棒沿一个方 向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏 水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停 止加入蒸馏水。 4、滤取含 DNA 的粘稠 物 用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至 1000 mL 的烧杯中。取 纱布上的 。 5、将 DNA 的粘稠物再 溶解 取一个 50 mL
6、烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为 20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至 NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌 3min，使黏稠 物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含 DNA 的氯化 钠溶液 取一个 100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶 液。取其滤液（DNA 溶于 中） 。 7、提取含 杂质较少的 DNA 在上述滤过的溶液中，加入 的、体积分数为 50 mL（加入时动作要慢） ，并作用玻璃棒沿一 个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒 上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻 璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。 8、DNA 的 鉴
7、定 取两支 20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为 5mL，将 丝状物放入其中 一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。 然后 ，向两支试 管中各加入 4 mL 的二苯胺试剂。混合均匀后， 将试管置于沸水中加热 5min，等试管冷却后，观察并且比较两 支试管中溶液颜色的变化。 三、操作提示 1、以血液为实验材料时，每 100ml 血液中需要加入 3g ，防止 。 2、加入洗涤剂后，动作要 、 ，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤 地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要 ，以免加剧 ，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要 ，否则会影响鉴定的效果。 四、课题成果评价 1、
8、是否提取出了 DNA 观察你提取的 DNA 颜色，如果不是白色丝状物，说明 DNA 中的 较多；二苯胺鉴定 出现蓝色说明实验 ，如果不呈现蓝色，可能所提取的 DNA ，或是实验操作 中出现 ，需要重新制备。 2、分析 DNA 中的杂质 本实验提取的 DNA 粗制品有可能仍然含有 、 、 等杂质。 3、不同实验方法的比较 对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料， 其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如 DNA 的 、 ， 二苯胺显色的 等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好 。 五、课题延伸 本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格
9、的科学实验中很少使用。实验室提取 高纯度的 DAN 时，通常使用 、 或 等化 学试剂。 【教材答案】 （一）旁栏思考题 1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种 液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细 胞 ，再加上搅拌的 ，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂）， 从而释放出 DNA。 2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能 ，有利于 DNA 的 ；食盐的主要成分 是 NaCl，有利于 。 3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全，提取的 DNA 量 ，影响实验结果， 导
10、致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：可能含有 、 和 等杂质。 5为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？ 答：用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去 ；用低盐浓度使 DNA 析出， 能除去 。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度 不同的多种杂质。 6方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用 分解杂质蛋白，从而使提取的 DNA 与蛋白质分开；方案三利用的 是 DNA 和蛋白质对 耐受性的不同，从而使蛋白质 ，与 DNA 分离。 （二）讨论题 图 5-1 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲
11、线，请根据曲线图，思考下面的问题 1在什么浓度下，DNA 的溶解度最小？DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度是如何变化的？ 答：在 NaCl 溶液浓度为 0.14mol/L 时， DNA 的溶解度最小；当 NaCl 溶液浓度低于 0.14mol/L 时，随着 NaCl 溶液浓度的升高，DNA 的溶解度 ；当 NaCl 溶液浓度高于 0.14mol/L 时，随着 NaCl 溶液浓度的升高，DNA 的溶解度 。 2如何通过控制 NaCl 溶 液的浓度使 DNA 在盐溶液中溶解或析出？ 答：根据 DNA 在 0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度最小的特性，一般先用较高浓度 的 NaCl 溶液使
12、 DNA 溶解，然后再用蒸馏水稀释至 使 DNA 析出。 （三）练习 1答：提取 DNA 的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取 DNA 含量 的生物材 料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是 DNA 的释放和溶 解，这一步是实验成功与否的关键，要 ；第三步是 DNA 的 纯化，即根据 DNA 的 、 对 及 的耐受性的不同 等特性，最大限度地将 DNA 与杂质分开；最后一步是对 DNA 进行鉴定， 这是对整个实验的结果的检测。 2答：提取蛋白质比提取 DNA 的难度大。这是因为，与 DNA 相比，蛋白质对温度、盐浓度、 pH 等条件要敏 感得多，很容易 ；并且蛋白
13、质的空间结构 ，理化性质 ，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件， 设计特定的方法。 【知识拓展】 1制备鸡血细胞液时，为什么要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠？ 答：制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠， 。其原 理是柠檬酸钠能与血浆中 Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的 Ca2+大大减 少，血液便不会凝固。 2鸡血离心或静置沉淀后，为什么要弃出上清液？ 答：因为上清液是 ，没有血细胞。 DNA 主要存在于试管底部的 中， 所以提取鸡血中的 DNA 时，要除去血液中的上清液。 3盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器，为什么？ 答：鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内 DNA 的含量本来 就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的 DNA 就会更少。因此，实验过程中最好 使用 的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的 DNA 的损失。 4为什么析出 DNA 时要用冷却的酒精？ 答：预冷的酒精溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶的活性，防止 DNA 降解；二是降 低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加 DNA 分子的柔韧性，减少断裂。
