1、专题 5 课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 一、基础知识 1PCR 原理 填写下列表格 参与的组分 在 DNA 复制中的作用 解旋酶 DNA 母链 合成子链的原料 DNA 聚合酶 引物 DNA 的两条链是反向平行的，通常将 DNA 的羟基末端称为 ，而磷酸基团的末端称为 。DN A 聚合酶不能 开始合成 DNA，而只能 ，因此，DNA 复制需要引 物。DNA 的合成方向总是 。 在 DNA 的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过控 制 来实现。在 的温度范围内，DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开， 这个过程称为 。 PCR 利用了 DNA 的 原理，通过控制温度来控制双链 的解
2、聚与结合。由于 PCR 过程的温度高，导致 DNA 聚合酶失活，后来 的 DNA 聚合酶 的发现和应用，大大增加了 PCR 的效率。 PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中提供： ， ， ， ，同时通过 控制温度使 DNA 复制在体外反复 进行。 2PCR 的反应过程 PCR 一般要经历 循环，每次循环可以分为 、 和 三步。 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而 成的 DNA 单链会与 结合，进行 DNA 的延伸，这样，DNA 聚合酶只能 ，使这段固定长度的序列成指数扩增。 3实验操作 在实验室中，做 PCR 通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移
3、液器，按 PCR 反应体系的配方 在 中依次加入各组分， ，再参照下表的设置设计 好 PCR 仪的循环程序即可。 4操作提示 为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的 、 、 以及蒸馏 水等在使用前必须进行 。PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添 加反应成分时，移液管上的枪头要 。 疑难点拨 1.PCR 技术简介 PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，它能以极少量的 DNA 为模板，在几小时 内复制 出上百万份的 DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低而难以对样品进 行
4、分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和 DNA 序列测定等各方面。 2细胞内参与 DNA 复制的各种组成成分及其作用 解旋酶：打开 DNA 双链 DNA 母链：提供 DNA复制的模板 4 种脱氧核苷酸：合成 子链的原料 DNA 聚合酶：催化合成 DNA 子链 引物：使 DNA 聚合酶能够从引物的 3， 端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段 DNA 或 RNA，它能与 DNA 母链的一段碱基序列互 补配对。用于 PCR 的引物长度通常为 2030 个核苷酸） 3DNA 的合成方向 DNA 的两条链是反向平行的，通常将 DNA 的羟基末端称为 3， 端，而磷酸基
5、团的末端称为 5， 端。DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3， 端延伸 DNA 链，因此，DNA 复制需 要引物。当引物与 DNA 母链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的 3， 端开始 延伸 DNA 链，DNA 的合成方向总是从子链的 5， 端向 3， 端延伸。 4PCR 的反应过程 PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到 90oC 以上时，双链 DNA 解聚为单链） 、复性（温度下降到 50oC 左右， 两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合）和延伸（温度上升到 72oC 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作
6、用 下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链）三步。从第二轮循环开 始，上一次循环的产 物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行 DNA 的 延伸，这样，DNA 聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度 的序列成指数扩增。 5PCR 技术与 DNA 的复制 PCR 反应是通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。PCR 反应的实质就是 DNA 复制，所以 有关 PCR 反应的题目与 DNA 复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR 反 应中的 目的片段一般以 2n的方式积累，其中 n 为反应循环次数。一个 DNA 片段在 30 次循环后反 应物中大约有 10 亿个这样的片段。 （2 30）
