1、专题 2 微生物的培养与应用 课题 2.1 微生物的实验室培养 一、 【课题目标】 （一）知识与技能 了解有关培养基的基础知识；掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本 操作技术 （二）过程与方法 分析实验思路的确定和形成的原因，分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性， 分析差异，增加印象 （三）情感、态度与价值观 形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神 二、 【课题重点】 无菌技术的操作 三、 【课题难点】 无菌技术的操作 四、 【教学方法】 启发式教学 五、 【教学工具】 多媒体课件 六、 【教学过程】 （一）引入新课 在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中
2、的微生物来自于制作过 程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持 发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学 习微生物的培养和应用专题。 （二）进行新课 1基础知识 11 培养基的种类包括 固体 培养基和 液体 培养基等。 思考 1琼脂是从红藻中提取的 多糖 ，在配制培养基中用作为 凝固剂 。 【补充】培养基的类型及其应用： 12 培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 四类营养成分。 标准 培养基类型 配制特点 主要应用 物理性质 固体培养基 加入琼脂较多 菌种分离,鉴定,计数 半固体培养基 加入琼脂较
3、少 菌种保存 液体培养基 不加入琼脂 工业生产，连续培养 化学组成 合成培养基 由已知成分配制而成，培养基成分明确 菌种分类、鉴定天然培养基 由天然成分配制而成，培养基成分不明确 工业生，产降低成本 目的用途 鉴别培养基 添加某种指示剂或化学药剂 菌种的鉴别选择培养基 添加（或缺少）某种化学成分 菌种的分离 思考 2从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？ C、H、O、N、P、S 是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的 97以上。 【补充】碳源：如 CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物， 并提供能量。 氮源：如 N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨
4、等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮 代谢物等。含有 C、H、O、N 的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。 13 培养基除满足微生物生长的 pH 、 特殊营养物质 和 氧气 等要求。 【补充】生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机 小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。 思考 3牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供 糖 、 维生素 和 有机氮 等营养物质。 思考 4培养乳酸杆菌时需要添加 维生素 ，培养霉菌时需要将培养基 pH 调节为 酸性 ，培养细菌时需要将 pH 调节为 中性或微碱性 。 活动 2：阅读“无菌技术” ，讨论回答下列问题： 14 获得纯净培
5、养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 。 15 无菌技术包括： （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。 16 比较消毒和灭菌（填表） 思考 5无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是 防止感染实验操作者 。 17 消毒方法： （1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法； （2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（作简要介绍） ； （3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等
6、溶液以增强消毒效 果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。 （4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒； （5）饮水水源用 氯气 进行消毒。 18 灭菌方法： （1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法； （2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ； （3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 。 （4）表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。 比较项 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 较为温和 部分生活状态的微生物 不能 灭菌 强烈 全部微生物 能 思考 6对接种环灭菌时要用酒
7、精灯的 充分燃烧 层火焰灼烧可能伸入试管或培养 皿的部位。 思考 7利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热 空气流通。 思考 8物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷 空气，其目的是 有利于锅内温度升高 ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 100k Pa， 温度为 121 ，并维持 1530 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 零 时打开锅盖，其目的是防止 容器中的液体暴沸 。 【补充】培养基的配制原则： 目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。 营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适
8、宜。例如：碳氮比 41 时， 谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为 31 时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合 成量大增。 pH 要适宜：细菌培养基 pH 中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。 2实验操作 21 计算：根据配方比例，计算 100mL 培养基各成分用量。 22 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏 吸收空气中水分。 23 溶化：加水加热熔化牛肉膏；加入蛋白胨和氯化钠继续加热；加入琼脂； 用蒸馏水定容到 100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破 裂。 24 调 pH：用 1mol/LNaOH 溶液调节 pH 至偏碱性。 25
9、 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌； 所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。 26 倒平板：待培养基冷却至 50左右时在酒精灯火焰附近操作进行。 其过程是： 在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞； 右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰； 左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。 待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 思考 1锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。 思考 2倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。 思考 3若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？ 不能
10、。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 思考 4配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。 思考 5试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。 27 接种 271 微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和 斜面接种等。 272 平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是： 将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。 在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。 将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。 将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。 将菌种
11、试管口再次通过火焰后塞上棉塞。 将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划 35 条平行线，盖上皿盖，不要划破 培养基。 灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完 成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。 将平板倒置放在培养箱中培养。 思考 6取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外， 其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种 环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境 和操作者。 思考 7在第 1 次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个
12、细菌形成的标 准菌落。 273 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂 布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌 落。 274 系列稀释操作： 取盛有 9mL 水的无菌试管 6 支，编号 101、102、103、104、105、106。 用灼烧冷却的移液管吸取 1mL 菌液注入编号为 101 试管中，并吹打 3 次，使之混匀。 从 101 倍液中吸取 1mL 菌液注入到编号为 102 试管内吹打均匀，获得 102 倍液。依 此类推。 思考 8操作中试管口和移液管应在离火焰 12cm 处。整个操作过程中使用了 1 支 移液管。 3
13、结果分析与评价 31 培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。 32 在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。 33 培养 12h 和 24h 后的菌落大小不同（相同、不同） ；菌落分布位置相同（相同、 不同） 。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落 数增多。 思考 9在某培养基上出现了 3 种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂 菌感染等。 思考 10频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。 前者利用固体斜面培养基培养后，保存在 4冰箱中，每 36 个月转种培养一次，缺点是
14、 保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在20冷 冻箱中。 （三）课堂总结、点评 微 生 物 的 实 验 室 培 养 培养基 无菌技术 纯化大肠杆菌 培养基的配制 配制培养基的原则 配制培养基的方法 计算称量溶化 调 pH分装 加棉 塞灭菌倒平板 平板划线法 稀释涂布法 系列稀释 平板涂布 （四）实例探究 例 1关微生物营养物质的叙述中，正确的是 A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对 于 A、B 选项，它的表达是
15、不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时 是氮源，如 NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源， 如蛋白胨。对于 C 选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为 自养型微生物的碳源；NaHC O3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而 NaCl 则只能提 供无机盐。对于 D 选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如 NH3可为硝化细菌提供 能量和氮源。 答案：D 例 2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个
16、重要环节。A 说的是灭菌的目的，因为发酵所用 的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌） ，所以是正确的；B 是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭 全部微生物。C 是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生 物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。 答案：B 综合应用 例 3右表是某微生物培养基成分，请据此回答： 编号 成分 含量 粉状硫 10g （NH 4） 2SO4 0.4g K2HPO4 4.0g MgSO4 9.25g （1）右表培养基可培养的微生物类型 是 。 （
17、2）若不慎将过量 NaCl 加入培养基中。 如不想浪费此培养基，可再加入 ， 用于培养 。 （3）若除去成分，加入（CH 2O） ，该培 养基可用于培养 。 （4）表中营养成分共有 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都溶化 后分装前，要进行的是 。 （6）右表中各成分重量确定的原则是 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。 解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于 合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。 分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺 乏碳源和特殊营
18、养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需 要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的 微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴 别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培 养基若加入（CH 2O） ，培养基中就有了碳源，但除去成分，却使培养基中没有了氮源，这 时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝 固剂，需要加入常见的凝固剂琼脂。 答案：自养型微生物 含碳有机物 金黄色葡萄球菌 固氮微 生物 3 调整 pH 依微生物的生长
19、需要确定 琼脂（或凝 固剂） （五）巩固练习 1不可能作为异养微生物碳源的是 A牛肉膏 B含碳有机物 C石油 D含碳无机物 2根瘤菌能利用的营养物质的组别是 ANH 3， （CH 2O） ，NaCl BN 2， （CH 2O） ，CaCl 2 C铵盐，CO 2，NaCl DNO 2，CO 2，CaCl 2 3配制培养基的叙述中正确的是 A制作固体培养基必须加入琼脂 B加入青霉素可得到放线菌 C培养自生固氮菌不需氮源 D发酵工程一般用半固体培养基 4自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是 A碳源 B氮源 C无机盐 D特殊营养物质 5下表是有关 4 种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的概述
20、。其中正确的是( ) 生 物 硝化细菌 根瘤菌 酵母菌 谷氨酸棒状杆菌 FeSO4 0.5g CaCl2 0.5g H2O 100ml 能 源 氧化 NH3 N2的固定 分解糖类等有机物 光 能 碳 源 C02 糖类 糖类 糖类 氮 源 NH3 N2 NH4+、NO 3- 尿 素 代谢类型 自养需氧型 异养需氧型 异养兼性厌氧型 自养需氧型 A根瘤菌、谷氨酸棒状杆菌 B硝化细菌、酵母菌 C酵母菌、谷氨酸棒状杆菌 D硝化细菌、根瘤菌 6甲、乙、丙是三种微生物，下表、是用来培养微生物的三种培养基。甲、 乙、丙都能在种正常生长繁殖；甲能在中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在 中正常生长繁殖，甲、丙
21、都不能。下列说法正确的是 （ ） 粉状硫 10g K2HPO4 4g FeSO 4 0.5g 蔗糖 10g （NH 4） 2SO4 0.4g H2O 100ml MgSO4 9.25g CaCl2 0.5g + + + + - + + + + + + - + + + + + + + + + + + + A、甲、乙、丙都是异养微生物 B、甲、乙、丙都是自养微生物、丙是异养微生物 C、甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物 D、甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物 7微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。 下列有关微生物营养的说法正确的是 A乳
22、酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的 B微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子 C培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利 D生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不 足。 8某一种细菌株要从环境中提取现成的亮氨酸（20 种氨基酸中的一种）才能生长， 此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。根据实 验年目的，选用的培养基类型是（ ） 注：亮氨酸 链霉素 “”加入 “”不加入 如：不加亮氨酸 ：加入链霉素 选项 筛选出不需要亮氨酸的 菌株 筛选出抗链霉素的 菌株 筛选出不需要亮氨酸的抗链霉素 的菌株 9要将从土壤
23、中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在 A加入氮源和杀菌剂的培养基上 B不加入氮源和不加杀菌剂的培养基上 C加入氮源，不加杀菌剂的培养基上 D不含氮源和杀菌剂的培养基上 10酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微 生物的生长，原因是 A碳源供应太充足 B细胞会发生质壁分离 C改变了酵母菌的 pH 值 D葡萄糖不是酵母菌的原料 答案：DACAC CDBBB 七、 【课余作业】 、收集生活中与微生物有关的实例，并通过所学知识对其进行解释 、我们打针输液时，首先要用酒精擦拭针刺处，为什么？ 八、 【教学体会】 本节课可以通过生产实例导入，使学生认识在微
24、生物的培养过程中，保持培养物纯净 的重要性。在课堂上可以跳出教材，充分发挥学生的主动性，让学生收集列举更多的生产 生活中的实例，从中体会培养物纯净的重要性。当时由于微生物的微观性和危害性，一定 要教育学生培养良好的卫生习惯。 九、 【资料袋】 微生物的特点 1.个体微小，结构简单 在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。 2.繁殖快 生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。 3.代谢类型多，活性强。 4.分布广泛 有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。 5.数量多 在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。 6.易变异 相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量 仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。 所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。
