1、专题 5 DNA 和蛋白质技术 第 16 课时 DNA 的粗提取与鉴定 目标导航 1.了解 DNA 的物理性质。2.理解 DNA 粗提取以及 DNA 鉴定的原理。 一、提取 DNA 的方法 1提取生物大分子的基本思路 (1)选用一定的_或_方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 (2)DNA 的粗提取就是利用 DNA 与_、_和_等在物理或化学性质方 面的差异，提取 DNA，去除其他成分。 2提取 DNA 分子的基本原理 (1)利用 DNA 的溶解性 DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，利用这一点，选择适 当浓度的 NaCl 溶液就能使 DNA 溶解，而使
2、杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。 DNA 与蛋白质在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同。 溶解规律 2 mol/L NaCl 0.14 mol/L NaCl DNA 在 NaCl 溶液中，浓度为_ mol/L 时溶解度_ 溶解 析出 蛋白质 NaCl 浓度从 2 mol/L 降低过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析 溶解 由上表可以看出，在 NaCl 为 2 mol/L 时 DNA_，而部分蛋白质发生盐析而生成 _，通过过滤可除去部分_；NaCl 为 0.14 mol/L 时 DNA_，过滤可 除去溶解的部分_。 DNA 不_ 酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则 _酒精。利用这一原理
3、，可将 DNA 与蛋白质进一步分离。 (2)利用 DNA 和蛋白质对酶、_和_的耐受性不同 蛋白酶能水解蛋白质，但对_没有影响。 大多数蛋白质不能忍受_的高温，而 DNA 在 80以上才会变性。 洗涤剂能够溶解_，但对_没有影响。 (3)DNA 的鉴定：DNA 在沸水浴的条件下，遇_会染成_。 二、提取 DNA 及鉴定 DNA 的实验流程 1实验材料的选取 实验材料的选择原则是选用_含量高的生物组织。有些材料不宜选用，如有些哺乳 动物的成熟红细胞无细胞核，无法提取 DNA。实验中一般选用_或_作为实 验材料。 2破碎细胞，获取含 DNA 的滤液 (1)动物细胞一般采用_破碎的方法。 (2)植物
4、细胞需要先用_溶解细胞膜，再加入一定量 _，进行充分的搅拌和 研磨，过滤后收集_。 归纳总结 动、植物细胞在获取 DNA 滤液方面的比较 原理 方法 动物细胞来源: www.shulihua.n et (鸡血细胞) 在低渗溶液中会吸水涨破 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液 植物细胞(洋葱) 洗涤剂能够溶解细胞膜 在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 3.去除滤液中的杂质 释放出的核物质是 DNA、RNA 和蛋白质等的混合物，根据不同的方案，可采用以下三种 去除滤液中杂质的方案。 原理 方法 方 案 一 DNA 在不同浓度的
5、_溶液中溶解 度不同 在滤液中加入 NaCl，使其溶液浓度为 2 mol/L，过滤除去 不溶的杂质 调节滤液中的 NaCl 溶液浓度为 0.14 mol/L，析出 DNA， 过滤去除溶液中溶解的杂质 方 案 二 DNA 对酶的耐受性 直接在滤液中加入_，_中的_能够分解蛋白质，反应 1015 min 方 案 三 DNA 对高温的耐受 性 将滤液放在_的恒温水浴箱中保温 1015 min，注 意严格控制温度范围，使_沉淀，而_分子还未 变性，可以将 DNA 与蛋白质分开 4.DNA 的析出 (1)原理：DNA 不溶于_，但细胞中的某些蛋白质则能溶于酒精。 (2)方法 将过滤得到的含 DNA 的黏
6、稠物溶于 _的 NaCl 溶液，再过滤得到含 DNA 的滤液。 向滤液中加入与滤液体积相等的、冷却的、体积分数为_的酒精溶液，静置 23 min，溶液中会出现_丝状物，它就是粗提取的 DNA。 用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 (3)目的 析出 DNA； 去除溶于酒精的杂质。 5DNA 的鉴定 (1)鉴定原理：DNA_ _ 5 min (2)步骤 两支 20 mL 的试管来源: 学科网来源:学科网 ZXXK来源:学科网 项目来源:学&科&网 Z&X&X&K 来源:学科网 ZXXK来源:学科网 ZXXK来源:学科网来源:学+ 科+ 网 Z+X+X+K 1 号 2 号
7、加入 2 mol/L 的 NaCl 溶液 5 mL 5 mL 加入丝状物(DNA) 用玻璃棒搅拌 _溶解 加入二苯胺试剂 4 mL 4 mL 实 验 步 骤 沸水浴加热 5 min 5 min 观察现象 _ 变蓝 提醒 (1)甲基绿可将 DNA 染成绿色，且不需水浴加热。二苯胺鉴定 DNA 属于颜色反应， 需要水浴加热 5 min，可使 DNA 呈蓝色。 (2)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。 6对实验结果作出分析与评价 (1)鉴别提取的 DNA 观察你 提取的 DNA 颜色，如果不是_，说明 DNA 中的杂质较多；二苯胺 鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现_
8、，可能所提取的 DNA 含量低，或 是实验操作中出现错误，需要重新提取。 (2)分析 DNA 中的杂质 本实验提取的 DNA 粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 (3)不同实验方法的比较 对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料， 其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如 DNA 的纯度、DNA 的颜 色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。 知识点一 提取 DNA 的方法 1DNA 的粗提取与鉴定实验，与下列哪项原理无关( ) ADNA 在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中，溶解度最低 BDNA 易
9、被龙胆紫溶液染成紫色 CDNA 溶液中加入二苯胺试剂，加热后产生蓝色 D加入 95%的冷酒精，DNA 会从溶液中析出 2下列图示中能正确反映 DNA 溶解度与 NaCl 溶液浓度之间关系的是( ) 知识点二 DNA 的提取流程 3下图为“DNA 的粗提取与鉴定”实验装置： (1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血细胞液中有较高含量的 _。 (2)在图 A 所示的实验步骤中加蒸馏水的目的是_，通过图 B 所示的步骤取得滤液， 再在溶液中加入 2 mol/L 的 NaCl 溶液的目的是_； 图 C 所示实验步骤中加蒸馏水的目的是_。 4将粗提取的 DNA 丝状物分别加入 0.14
10、 mol/L NaCl 溶液、2 mol/L NaCl 溶液、体积分数 为 95%的酒精溶液中，然后用放有纱布的漏斗过滤，分别得到滤液 P、Q、R 以及存留在纱 布上的黏稠物 p、q、r，其中由于含 DNA 少可以丢弃的是( ) AP、Q、R Bp、q、 r CP、q、R Dp、Q 、r 一、选择题 1从鸡血细胞液中提取 DNA 所用的提取液是( ) ANaCl 溶液 B酒精 C二苯胺 D柠檬酸钠 2去除 DNA 杂质时，可直接在滤液中加入_，反应 1015 min( ) A嫩肉粉 B蒸馏水 C2 molL1NaCl 溶液 D酒精 3在“DNA 的粗提取与鉴定”实验过程中，有两次 DNA 沉淀
11、析出，其依据的原理是( ) DNA 在物质的量浓度为 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最低 DNA 在冷却的体积分数为 95%的酒精中能沉淀析出 A两次都是 B两次都是 C第一次是，第二次是 D第一次是，第二次是 4在 DNA 的粗提取实验过程中，对 DNA 提取量影响较小的是( ) A使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，释放出 DNA 等核物质 B搅拌时要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C在析出 DNA 黏稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至黏稠物不再增多 D要用冷酒精沉淀 DNA，甚至可将混合液再放入冰箱中冷却 5蛋白酶能使蛋白质水解而使染色质中的 DNA 分离出来，下列药品可达到上述同一
12、目的 的 是( ) A蒸馏水 BNaCl 溶液 CNaOH 溶液 D盐酸 6在 采用鸡血为材料对 DNA 进行粗提取的实验中，若需进一步提取含杂质较少的 DNA，可以依据的原理是( ) A在物质的量浓度为 0.14 mol/L NaCl 溶液中 DNA 的溶解度最小 BDNA 遇二苯胺在沸水浴的条件下会染成蓝色 CDNA 不溶于酒精而细胞中的一些物质易溶于酒精 D质量浓度为 0.1 g/mL 的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用 7若选择的实验材料为植物细胞，破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐。加入食盐的 目的是( ) A有利于 DNA 的溶解 B分离 DNA 和蛋白质 C溶解细胞膜 D溶解蛋白质
13、8向溶解 DNA 的 NaCl 溶液中不断加入蒸馏水的目的是( ) A加快溶解 DNA 的速度 B加快溶解杂质的速度 C降低 DNA 的溶解度，加快 DNA 的析出 D降低杂质的溶解度，加快杂质的析出 二、简答题 9在“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，为得到含 DNA 的黏稠物，某同学进行了如下操作， 最后所得含 DNA 的黏稠物极少，导致下一步实验无法进行。请指出该同学实验操作上的 错误并改正。 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，经离心后，除去血浆，留下血细胞备用。 取 5 10 mL 血细胞放入 50 mL 的塑料烧杯中，并立即注入 20 mL 0.015 mol/L 的氯化钠 溶液，快速搅
14、拌 5 min 后经滤纸过滤，取得其滤液。 向滤液中加入 40 mL 2 mol/L 的氯化钠溶液，并用玻璃棒沿一个方向快速搅拌 1 min。 向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地边轻轻搅拌边加入蒸馏 水，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤得含 DNA 的黏稠物。 实验结果：所得含 DNA 的黏稠物极少，导致下一步实验无法进行。 (1)请指出并改正上述实验操作中的错误：_ _ _ _。 (2)要进一步提取 DNA 时，需加入冷却的酒精，其作用是_和 _。 (3)由于鸡血较难找到，某同学试图用人血代替，结果没有成功，其原因最可能是 _ _。 (4)鉴定实验中所得到的丝状物的
15、主要成分为 DNA，可滴加_试剂，沸水浴，如果 出现_现象，则该丝状物的主要成分为 DNA。 10实验中对 DNA 进行鉴定时，做如下操作： 试管 序号 A B 1 加 2 mol/L 的 NaCl 溶液 5 mL 加 2 mol/L 的 NaCl 溶液 5 mL 2 不加 加入提取的 DNA 丝状物并搅拌 3 加 4 mL 二苯胺，混匀 加 4 mL 二苯胺，混匀 4 沸水浴 5 分钟 沸水浴 5 分钟 实现现象 实验结论 (1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。 (2)对于 B 试管，完成 1、2、3 的操作后溶液颜色如何？ _。 (3)在沸水浴中加热的目的是_ ， 同时说明 DNA 对
16、高温有较强的_。 (4)A 试管在实验中的作用是 _。 (5)B 试管中溶液颜色的变化程度主要与_有关。 第 16 课时 DNA 的粗提取与鉴定 知识清单 一、1.(1)物理 化学 (2) RNA 蛋白质 脂质 2(1)0.14 最小 溶解 沉淀 蛋白质 析出 蛋白质 溶于 溶于 (2) 高温 洗涤剂 DNA 6080 细胞膜 DNA (3)二苯胺 蓝色 二、1.DNA 鸡血 菜花 2(1)加蒸馏水 (2) 洗涤剂 食盐 研磨液 3NaCl 嫩肉粉 嫩肉粉 木瓜蛋白酶 6075 蛋白质 DNA 4(1)酒精 (2)2 mol/L 95% 白色 5(1)二苯胺 沸水浴 蓝色 (2)丝状物 不变蓝
17、 6(1)白色丝状物 蓝色 对点训练 1B DNA 在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最低。DNA 鉴定选用的试剂为二苯胺试 剂，加热后(沸水浴)产生蓝色。加入 95%的冷却的酒精，由于 DNA 不溶于酒精，DNA 会 从溶液中析出。 规律链接 “DNA 粗提取与鉴定”实验材料选用鸡血细胞液，而不是鸡全血，主要原因是 DNA 主要贮存于细胞核内，而不在血浆内，使用鸡血细胞液提高材料中的细胞数量和 DNA 含量，从而可以保证实验能提取到足够的 DNA。 2C 在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中 DNA 的溶解度最小。 3(1)DNA (2)使血细胞破裂 使滤液中的
18、DNA 溶于浓 NaCl 溶液 使 DNA 析出 解析 题图 A、B、C 所示为本实验的三个关键步骤。图 A 通过添加蒸馏水，血细胞与蒸 馏水相混合而使血细胞处于极度低渗的环境之中，细胞因大量吸水而最终破裂。图 B 通过 纱布过滤使血细胞释放出的 DNA 滤入收集的滤液中(将大量胶状物滤出)，再在滤液中加入 2 mol/L 的 NaCl 溶液使 DNA 的溶解度增加。DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同， 如在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度只有水中的 1%，而在 1 mol/L 的 NaCl 溶液中的溶解 度为水中的 2 倍。即使 DNA 溶于 NaCl 溶液，
19、图 C 在 DNA 浓盐溶液中加入蒸馏水(大量)， 可使溶液的 NaCl 浓度降至较低，由于 DNA 在较低浓度的 NaCl 溶液中溶解度很低(在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最低，浓度再变小则 DNA 溶解度将增大)，使 DNA 低渗析出， 经过滤等手段可以收集到 DNA。 规律链接 1DNA 粗提取与鉴定实验中的数字总结 (1)1 次加入酒精：提取含杂质较少的 DNA DNA 不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。在含 DNA 的溶液中加入冷却的 体积分数为 95%的酒精，其目的是为了提取含杂质较少的 DNA。 (2)2 次加入蒸馏水：目的不同 第一次向鸡血细胞
20、液中加入蒸馏水，是为了得到浓度低于血细胞内部浓度的溶液。这样水 分子会大量渗入血细胞中，使血细胞吸水涨破而释放 DNA。 第二次向 2 mol/L NaCl 溶液中加入蒸馏水，是为了使 NaCl 溶液的浓度降低到 0.14 mol/L， 从而使 DNA 分子从 NaCl 溶液中析出。 (3)3 次过滤：DNA 存在的部分及所用的纱布层数不同 第一次过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液，是为了得到含 DNA 的滤液，使用的纱布为 12 层。 第二次过滤含有黏稠物的 NaCl 溶液，是为了得到从低浓度的 NaCl 溶液中析出的附着在纱 布上的含 DNA 的黏稠物，所用的纱布为多层。 第三次过滤溶解有 D
21、NA 的 NaCl 溶液，目的是为了使 DNA 再溶解，所以只要用两层纱布 即可。 (4)4 次调整 NaCl 溶液的浓度：目的不同、使用的 NaCl 溶液的浓度不同 第一次在含 DNA 的滤液中，加入 NaCl，调整 NaCl 溶液的物质的量浓度为 2 mol/L ，必 须充分混合均匀。目的是加速染色质中 DNA 与蛋白质的分离，使 DNA 充分游离并溶解在 NaCl 溶液中。 第二次调整 NaCl 溶液的物质的量浓度为 0.14 mol/L，此时 DNA 的溶解度最小，目的是析 出 DNA。 第三次调整 NaCl 溶液的物质的量浓度为 2 mol/L，目的是使 DNA 再次溶解。 第四次调
22、整 NaCl 溶液的物质的量浓度为 0.015 mol/L(或 2 mol/L)，目的还是为了溶解 DNA。 (5)6 次用玻璃棒搅拌：目的不同 第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液，目的是加速鸡血细胞的破裂。 第二次搅拌 2 mol/L 含 DNA 的 NaCl 溶液，目的是加速 DNA 的溶解。 第三次搅拌加蒸馏水的 NaCl 溶液，目的是均匀稀释 NaCl 溶液至 0.14 mol/L，以析出更多 的 DNA。 第四次搅拌含 DNA 的 2 mol/L 的 NaCl 溶液，目的是加速 DNA 的溶解。 第五次搅拌体积分数为 95%的含 DNA 的酒精，目的是提取含杂质较少的 DNA。 第六次搅
23、拌 0.015 mol/L(或 2 mol/L)含 DNA 的 NaCl 溶液，目的还是加速 DNA 的溶解。 2该实验成功的关键 (1)破碎细胞应彻底充分。 (2)对提取的含杂质较多的 DNA 进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。 (3)实验过程中，搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的 DNA 分子。 (4)由于玻璃表面带电荷，DNA 中的磷酸基也带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中应尽 量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的 DNA。 (5)常温下，二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 4C DNA 在 0.14 mol/L NaCl
24、溶液中溶解度最小，过滤后 DNA 在黏稠物 p 中，可以丢 弃 P；DNA 在 2 mol/L NaCl 溶液中溶解过滤后，DNA 在滤液中，可以丢弃 q；DNA 不溶 于体积分数为 95%的酒精溶液，所以过滤后 DNA 在黏稠物 r 中，可以丢弃 R。 联想 DNA 在 0.14 mol/L NaCl 溶液中溶解度最小，在高于或低于 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液 中溶解度变大，DNA 不溶于酒精，但蛋白质能溶于酒精，所以用酒精溶液可以除去 DNA 中的部分蛋白质杂质。 达标测试 1A 本题考查各试剂在“DNA 的粗提取与鉴定”实验中的作用。NaCl 溶液：溶解、析出 DNA；酒精
25、：溶解蛋白质，提纯 DNA；二苯胺：鉴定 DNA；柠檬酸钠：防止血液凝固。 2A 嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能分解蛋白质。 3C 考查 DNA 粗提取的原理，DNA 的第一次析出是利用 DNA 的溶解度在 0.14 mol/L NaCl 溶液中最小而沉淀析出的。第二次析出是利用 DNA 不溶于冷却的 95%的酒精，而蛋 白质等杂质可溶解于冷却的 95%的酒精这一原理，达到对第一次析出的 DNA 进一步分离 提纯的目的。 4B A 项的做法是为了充分释放出核中的 DNA 分子，使进入滤液中的 DNA 量尽量的 多；C 项是让 DNA 充分沉淀，保证 DNA 的量；D 项的道理同 C 项；而 B 项的操
26、作并不 能使 DNA 增多或减少。 5B 染色质中的主要成分是 DNA 和蛋白质，我们可以利用蛋白酶水解杂质蛋白质，从 而使提取的 DNA 与蛋白质分开。也可以利用 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度不同，DNA 在 2 mol/L NaCl 溶液中溶解度高，而蛋白质不能溶解，通过过滤可除去不能溶解的杂质蛋 白质，由此可看出两种方法虽然原理不同，但目的是一样的。 6C 考查 DNA 粗提取实验中各药品的作用，DNA 粗提取的原理有：DNA 在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最小和 DNA 不溶于 95%的冷酒精。进一步提取含杂质较少的 DNA 时用后者。B 项用于 DNA
27、鉴定，D 项中柠檬酸钠防止血液凝固。 7A 在解答本题时，不少同学会受“加入一定量的洗涤剂和食盐”的干扰，做出错误的判 断，误选 C，而忽略本题所考查的是食盐的作用。 8C DNA 分子在不同浓度的 NaCl 溶液中的溶解度不同，调节 NaCl 溶液的浓度可以使 DNA 溶解或析出，因此向溶解 DNA 的 NaCl 溶液中不断加入蒸馏水的目的是降低 DNA 的 溶解度，加快 DNA 的析出。 9(1)中“20 mL 0.015 mol/L 氯化钠溶 液”错误，应改为“20 mL 蒸馏水”； 中“ 经滤纸过 滤”错误，应改为“ 经纱布过滤” ； 中“ 直到溶液中出现丝状物为止”错误，应改为“ 直
28、到溶 液中丝状物不再增加时为止” (2)凝集 DNA 溶解其他物质 (3)人血成熟红细胞中没有细胞核 (4)二苯胺 蓝色 10(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA 在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 (2)溶液颜色基本不变(不呈浅蓝色 ) (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的 DNA(丝状物)的多少 解析 本题主要考查 DNA 分子的鉴定。A、B 两试管形成对照， B 试管中含 DNA 丝状物， A 试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热 5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。 第 17
29、 课时 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 目标导航 1.知道细胞内参与 DNA 复制的各种组成成分与反应条件；知道 DNA 合成方向。 2.理解 PCR 的原理；掌握 PCR 的基本步骤及每个步骤前后发生的变化。 一、PCR 技术的原理 1PCR 扩增方向 (1)3端和 5端：为了明确地表示 DNA 的方向，通常将 DNA 的羟基( OH)末端称为 _，而含_的末端称为_；一个双链 DNA 分子中含两个 3端和 两个 5端，如果一条链的方向是_，则另一条链的方向就是_，这就是反向 平行的含义。 (2)DNA 分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过_相连，该化学键是由一分 子脱氧核苷酸中 3 号碳原子
30、上的羟基(OH)，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中 5 号碳原子 上的磷酸基团脱水聚合而成。所以 DNA 的合成方向总是从子链的_向_延 伸。 2PCR 技术原理 (1)PCR 原理：DNA 分子在一定条件下可以进行半保留复制。 (2)DNA 的热变性原理：在_的温度范围内，DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开， 这个过程称为_；当温度缓慢下降后，两条被分离的 DNA 链又会重新结合成双链， 这个过程称为_。 3生物体内 DNA 复制与 PCR 反应的区别 体内复制 PCR 反应 解旋 在_作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至_，双链全部解开，不需解旋酶 引物 一小段 RNA 可以是 RNA 或
31、单链 DNA 分子片段 合成子 链 在引物基础上，一条链连续合成，另 一条链不连续合成 分别从两条链的_开始，都是连续 合成，控制温度_ 特点 _，半保留复制 体外迅速扩增 Taq DNA 聚 合酶 _ _ 循环次 数 受生物体自身控制 30 多次 相同点 生物体内的 DNA 复制和 PCR 体外 DNA 扩增都需要_ 、_作原料、 _，子链延伸的方向都是从_到_，且都需要在一定的缓冲溶液中 进行 二、PCR 的反应过程 1反应条件 (1)稳定的缓冲液环境。 (2)DNA 模板。 (3)分别与模板 DNA 两条模板链相结合的两种引物。 (4)A、T、G、C 四种脱氧核苷酸。 (5)耐高温的 D
32、NA 聚合酶，一般用 Taq DNA 聚合酶。 (6)能严格控制温度变化的温控设备。 2过程 (1)_(9095)：双链 DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链 DNA。 (2)_(55左右)：两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合，形成局部双链。 (3)_(72左右)：在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱 基互补配对原则，从引物的 5端3端延伸合成与模板互补的 DNA 链。 3结果 (1)PCR 的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也 做模板参与反应，并且由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行 DNA 的
33、延伸。 这样，DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的 DNA 序列呈_。 (2)PCR 一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为_。 三、PCR 反应的实验操作流程 1操作步骤 _：按照 PCR 反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 _：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分 _：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 _：将微量离心管放在离心机上，离心约 10 s。目的是使反应液集中在离心管底部 _：将离心管放入 PCR 仪中，设置程序进行反应 2操作提示 (1)避免外源 DNA 污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前
34、必须进行_。 (2)缓冲液和酶分装成小份，并在_储存。 (3)每添加一种反应成分，更换一个_的枪头。 (4)混匀后离心处理，使反应液集中在_底部。 3实验中 DNA 含量的测定 理论上 DNA 扩增呈指数增长，即一条 DNA 片段循环 n 次后的数目为 2n，但实际可能会 有诸多因素影响 DNA 含量，所以需要对 DNA 含量进行测定。 (1)原理 DNA 在 260 nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与 DNA 的含量有关。可以 利用 DNA 这一特点进行 DNA 含量的测定。 (2)过程 稀释： 2 L PCR 反应液，加入 98 L 蒸馏水，即将样品进行 50 倍稀释。 对照
35、调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长 260 nm 处，将紫外分光光度计的读数调节 至零。 测定：取 DNA 稀释液 100 L 至比色杯中，测定 260 nm 处的光吸收值。 计算： DNA 含量(g/mL)50(260 nm 的读数)稀释倍数。 知识点一 PCR 的原理和反应过程 1DNA 扩增过程中，DNA 片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是( ) 2在 PCR 扩增 DNA 的实验中，根据设计，一分子 DNA 经 30 次循环后，应得到约 230 个 DNA 分子，但结果只有约 210 个 DNA 分子。出现该现象的原因可能是( ) 循环次数不够 Taq DNA 聚合酶活力
36、不够或其活性受到抑制 引物不能与模板链 结合 系统设计欠妥 A B C D 知识点二 PCR 的实验操作 3在遗传病及刑侦破案中常需要对样品 DNA 进行分析，PCR 技术能快速扩增 DNA 片段， 在几个小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝，有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低而难 以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题： a 链 5GGTC3 5G G OH(引物) b 链 3CCAG5 _(引物) 95 5G GTC3 3CCAG5 55 5G GTC3 3CCAG5 5GG OH 72 _ _ (1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物 置于合适的位置。 (2)在
37、相应的横线上写出循环一次后生成的 DNA 分子。 (3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用 32P 标记，请分析循环一次后生成的 DNA 分子的特 点是_；循环 n 次后生成的 DNA 分子中不含放射性的单 链占总单链的比例为_。 4有关下列操作过程的叙述，错误的是( ) APCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭 菌 BPCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存 CPCR 所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 一、选择题 1下列有关 PCR 的描述，不正确的是 ( ) A
38、是一种酶促反应 B引物决定了扩增的特异性 CPCR 反应中的目的片段一般以 2n 指数扩增 D扩增对象是氨基酸序列 2DNA 的复制需要引物，其主要原因是( ) A可加快 DNA 的复制速度 B引物可与 DNA 母链通过碱基互补配对结合 C引物的 5端有助于 DNA 聚合酶延伸 DNA 链 DDNA 聚合酶只能从 3端延伸 DNA 链 3变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，但共价键并未断裂。引起变性的因素 很多，升高温度、过酸、过碱以及加入变性剂等都能造成核酸变性。PCR 的反应过程中， 引起变性的因素是( ) ApH 过高 BpH 过低 C升高温度 D加入酒精 4PCR 技术扩增 D
39、NA，需要的条件是( ) 目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶等 mRNA 核糖体 A B C D 5用 15N 标记的一个 DNA 分子放在含 14N 培养基中复制三次，含 15N 的 DNA 分子占全 部 DNA 分子的比例和含 15N 的 DNA 单链占全部 DNA 单链的比例依次是( ) A1/4,1/6 B1/4,1/8 C1/2,1/8 D1/2,1/4 6下图所示为 PCR 扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物( ) A第一次循环 B第二次循环 C第三次循环 D第四次循环 7关于 DNA 聚合酶催化合成 DNA 子链的说法中，正确的是( ) A以 DNA 为模板，使
40、 DNA 子链从 5端延伸到 3端的一种酶 BTaq DNA 聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加 CDNA 聚合酶能特异性地复制整个 DNA 的全部序列 DTaq DNA 聚合酶是从深海生态系统中发现的 8使用 PCR 仪具体实验操作顺序应为 ( ) 设计好 PCR 仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中 依次加入各组分 进行 PCR 反应 离心使反应液集中在离心管底部 A B C D 二、简答题 9下图是 PCR 技术示意图，请回答下列问题： (1)标准的 PCR 过程一般分为_、_、_三大步骤。 (2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段_。
41、(3)将双链 DNA_，使之变性，从而导致_。 (4)引物延伸需提供_ 作为原料。 10PCR 技术是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，操作步骤简介如下： 第步：准备“汤” 和模板 DNA A配制多聚酶链式反应“汤” 注： SPU 是一种溶液的计量单位；矿物油可防止聚合酶在冻结时受伤害，以保证酶的 活性； dNTP 有四种：dATP、dGTP、dCTP 、dTTP。 B准备要拷贝的 DNA 如要拷贝自己的 DNA 可以用一牙签轻刮口腔内壁，将牙签放入蒸馏水中摇动。加热使蒸 馏水沸腾，使细胞破碎释放出 DNA。用离心机离心后，去除蒸馏水中较大的细胞碎片。这 时上清液中就有了较纯的 DNA。
42、第步：多聚酶链式反应 将 DNA(B)放入汤 (A)中。 水浴加热。首先，95 ，使 DNA 双螺旋打开，历时 1 min；然后，55，使引物结合到 DNA 上，历时 30 s；最后，72 ，与 DNA 聚合酶结合 使 DNA 复制，历时 1 min。重复步骤 。每重复一次，即完成一次拷贝。 根据上述操作过程回答下列问题： (1)以上材料可以说明( ) ADNA 的复制必须在活细胞中才能完成 BDNA 能指导蛋白质的合成 C在合适的条件下，非细胞环境也能进行 DNA 的复制 DPCR 技术是一种无性生殖技术 (2)若用人体细胞内的遗传物质做 PCR 扩增，则扩增后的几百亿个 DNA 分子起码可
43、分为 46 种。要将其分开，可用电泳、染色等技术，常用的试剂有溴化乙锭等。有些试剂毒性较强， 因此应戴上化学实验专用手套作为保护措施，以免其与皮肤接触。溴化乙锭是一种强烈的 诱变物，若接触皮肤活细胞，很可能会引起( ) A基因重组 B该个体会产生变异较大的后代 C癌变 D皮肤外层是死细胞，该物质接触皮肤后对人体不会有影响 (3)PCR 技术中用到的 DNA 聚合酶，取自生长在热泉中的一种细菌。就 PCR 技术来讲，你 认为使用这种细菌中提取的酶较普通的动植物体内提取的 DNA 聚合酶的优势是 _。 (4)PCR 技术能将某一 DNA 分子扩增成许多相同的 DNA 片段，原因是：DNA 分子具有 _结构；DNA 复制时遵循_ 原则。 (5)DNA 分子进行扩增时，除了所要扩增的 DNA 片段外，还需要四种 _、_和_
