1、石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化1石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化学院生命科学学院专业生物技术班级生技2010级2班学号2010506048学生姓名指导教师中国新疆石河子二一四年六月石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化2海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化学生指导老师摘要已经证明，被子植物共享一个保守的磷脂酰乙醇胺结合（PEBP）结构域来调控开花时间。PEBP家族包括FTLIKE，TFL1LIKE和MFTLIKE三个亚家族，进化分析表明MOTHEROFFTANDTFL1MFT是所有PEBP基因的祖先10。
2、蛋白质序列比对发现GBMFT2蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸，系统进化树分析表明GBMFT2编码产物与拟南芥ATMFT蛋白亲缘关系较近，他们属于同一分支。用不同浓度的ABA处理棉花种子后GBMFT2基因表达变化明显，表明GBMFT2基因的表达受ABA的调节。为了进一步研究该基因的功能，将过量表达载体P35SGBMFT2叶盘法转化烟草，获得了7株T1代GBMFT2转基因烟草。种植T2代转基因烟草，发现转基因植株的开花时间均晚于非转基因植株。并用不同浓度NACL胁迫处理T2代转GBMFT2基因烟草幼苗，发现转基因烟草的耐盐性明显高于野生型烟草。进一步分析GBMFT2基因的功能，以便可以利
3、用该基因调节作物的开花时间及耐盐性。关键词PEBP家族；GBMFT2基因；叶盘法；晚花；耐盐GENETICTRANSFORMATIONOFGOSSYPIUMBARBADENSEGBMFT2INTOBACCOABSTRACTANGIOSPERMSHARINGACONSERVEDPHOSPHATIDYLETHANOLAMINEBINDINGPEBPDOMAINHAVEBEENSHOWNTOBEINVOLVEDINTHECONTROLOFFLOWERINGTIMETHEFAMILYISDIVIDEDINTOTHREESUBFAMILIES,FTLIKE,TFL1LIKEANDMFTLIKEEVOLU
4、TIONANALYSISSHOWEDTHATMOTHEROFFTANDTFL1MFTISTHEANCESTRALFORMOFALLPEBPGENESINPLANT,GBMFT2GENEHASAPEBPCONSERVEDMOTIFINCONSISTENCYWITHALMOSTALLMFTLIKEPROTEINS,GBMFT2HASACONSERVEDPROLINERESIDUENEARTHECTERMINUSSIMILARITIESSIMILARWITHATMFTANDTHEYALLBELONGTOTHESAMECLADEEXOGENOUSABSCISICACIDABAOFDIFFERENTCO
5、NCENTRATIONSRESULTEDINSIGNIFICANTCHANGEINGBMFT2EXPRESSIONINGERMINATINGSEEDS,INDICATING石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化3THATTHEEXPRESSIONOFTHISGENEISREGULATEDBYABATOFURTHERSTUDYTHEFUNCTIONOFTHEGENE,ITRANSFORMEDTHEOVEREXPRESSIONVECTOROFP35SGBMFT2INTOTOBACCO7P35SGBMFT2TRANSFORMEDTOBACCOPLANTSWEREACQUIRE
6、DANALYSISSHOWEDTHATTHEP35SGBMFT2TRANSFORMEDTOBACCOSHOWEDLATTERFLOWERPHENOTYPETHANNONTRANSGENICWILDTYPEPLANTSBESIDES,THROUGHSALTTOLERANCEANALYSISIFOUNDTHATTHEP35SGBMFT2TRANSFORMEDTOBACCOSHOWEDSTRONGERSALTTOLERANCETHANNONTRANSGENICWILDTYPEPLANTSSOINTHEFURTHERWECANUSETHEGBMFT2GENEFORREGULATINGTHETIMEOF
7、THEFLOWERSANDTHESALTTOLERANCEOFTHECROPSKEYWORDPEBPFAMILYGBMFT2GENESALTTOLERANGCELATEFLOWERING前言金鱼草CENTRORADIALISCEN）基因的突变造成正常的无限花序被破坏，茎端形成顶花，克隆研究表明CEN蛋白与动物的磷脂酰乙醇胺结合蛋白PHOSPHATIDYLETHANOLAMINEBINDINGPROTEINS，PEBP很相似1。利用CEN基因作为异源探针从拟南芥中克隆了一个同源基因TERMINALFLOWER1TFL1，TFL1突变体开花提早，顶端分生组织由无限生长变成有限生长，表明TFL1具有
8、维持顶端分生组织无限生长的能力2。FLOWERINGLOCUST（FT）是拟南芥中的一个开花位点的控制基因，FT和TFL1氨基酸序列相似性为71，二者同属PEBP基因家族3。FT和TFL1蛋白晶体结构分析表明二者高度相似，形成一个包含阴离子结合位点的口袋，口袋入口处的关键氨基酸对于FT和TFL1功能的转变起着重要作用4。TFL1的HIS88/ASP144在结合口袋的入口处形成氢键，而FT的TYR85/GLN140不能形成氢键，这在决定蛋白的特定功能上起着关键作用，把这个口袋里的单个氨基酸改变，就可以使FT变成TFL1，相反也是这样5。拟南芥基因组的PEBP基因家族还包括ARABIDOPSIST
9、HALIANACENTRORADIALISATC、BROTHEROFFTANDTFL1BFT、MOTHEROFFTANDTFL1MFT和TWINSISTEROFFTTSF6。系统进化研究表明，PEBP家族基因主要分为MFTLIKE，FTLIKE和TFL1LIKE3个亚家族，该基因家族成员起着开花促进因子石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化4或开花抑制因子的作用。FT是一个开花促进因子，它整合来自不同途径的信号从而控制开花，已经证明FT蛋白是一个从叶片到顶端分生组织的长距离运输信号，是拟南芥的成花素11。水稻中的HEADINGDATE3AHD3A是拟南芥FT的同源基因，
10、HD3A蛋白即水稻中的成花激素7，HD3A基因在叶片中表达并通过微管组织运输到顶端分生组织，同成花素受体1433蛋白结合，然后又附着到另一种转录因子OSFD1上形成成花素激活复合体，使开花基因OSMADS15功能活跃起来8。近年来研究发现，除了对开花的控制功能外，FTLIKE和TFL1LIKE还涉及到很多不同功能，如马铃薯块茎的形成、茎的伸长、杨树芽的休眠、顶端分生组织生长前的衰减9等。相对于FTLIKE和TFL1LIKE基因，MFTLIKE基因的研究仍然很有限。进化分析认为MFT是植物PEBP家族基因的祖先10。MFT基因也具有促进开花的作用，但失去功能的MFT突变体在正常生长条件下没有明显
11、的表型9。ABA和GA是种子适应外界环境的生物和非生物胁迫调节种子发芽的2个重要的拮抗激素，近年来的研究表明，MFT参与了ABA和GA信号通道在种子发芽过程中起着重要的调节作用11。拟南芥MFT在种子萌发过程中的胚根和下胚轴的转变区特异表达，MFT的转录分别受到ABA信号通道中的2个关键的转录因子ABAINSENSITIVE3ABI3和ABI5的调节，并且DELLA蛋白RGALIKE2RGL2可以明显地促进MFT的转录。HEDMAN等10研究发现被子植物MFTLIKE含有两个亚家族A亚家族和B亚家族，A亚家族在双子叶植物和单子叶禾本科植物都存在，B亚家族仅在双子叶植物中存在，在MFTLIKE基
12、因的进化过程中其中一类MFTLIKE基因发生了丢失，而A亚家族基因一般羧基末端都含有保守的脯氨酸残基PRO，B亚家族基因一般都含有保守的谷氨酸残基GLU。棉花是重要的经济作物，开花早晚和产量、品质性状之间存在显著相关，并且影响霜前皮棉产量、纤维长度等。相对于拟南芥和水稻等植物，棉花的PEBP基因家族的功能研究报道较少。东锐等12从陆地棉中克隆了一个FTLIKE基因GHFTL1，该基因具有FTLIKE基因的结构，且在拟南芥中过量表达，长日照下明显的促进早花。顾超等13从棉花中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GBMFT1，用不同浓度的ABA处理棉花种子发现GBMFT1基因的表达不受ABA的调节
13、。本研究从海岛棉中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GBMFT2，对棉花种子用不同浓度ABA胁迫，分析GBMFT2的表达情况，发现GBMFT1基因的表达受ABA的调节，此外，将过表达载体P35SGBMFT2叶盘法转入烟草，统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间，并且石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化5进一步探索该基因的功能，对T2代转基因烟草进行盐胁迫处理，对其耐盐性进行分析，为进一步完善棉花PEBP基因家族的功能奠定了基础。1材料与方法11实验材料111植物材料普通烟草（NICOTIANATABACUM）为本实验室保存。112菌种、载体及试剂含有重组质粒P35SG
14、BMFT2的甘油农杆菌为本实验室保存；TRISBASE、EDTA、CTAB等生化试剂，均购自上海生工生物工程有限公司；10EXTAQBUFFER、25MMOL/LDNTPMIXTURE、RTAQ酶、5PRIMESCRIPTBUFFER、RNASEINHIBITOR、PRIMESCRIPTTRANSCRIPTASE均购自TAKARA公司；TRIZOL试剂盒购自INVITROGEN公司；DNA分子量MARKER购自东盛公司所用引物均由北京华大基因有限公司合成。113培养基LB固体/液体培养基胰蛋白胨（TRYPTONE）10G/L；酵母提取物（YEASTEXTRACT）5G/L；氯化钠（NACL）1
15、0G/L，若配制LB固体培养基需加入15G/L琼脂粉（AGARA）。若配制LB（KANRIF）双抗培养基，则需加入经过过滤灭菌的卡那霉素（KAN）和利福平（RIF）母液，使其工作浓度分别为50MG/L、25MG/L。1/2MS培养基蔗糖（SUCROSE）300G/L；MS（MURASHIGE9430S,5545S，7240S后扩增（内参基因扩增28CYCLES，GBMFT2扩增30CYCLES）；72延伸10MIN。125T2代转基因烟草表性分析1251T2代烟草种子的处理及种植70酒精消毒2MIN，再加入20NACLO消毒7MIN，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有20
16、0MG/LKAN的1/2MS筛选培养基上。至于暗培养箱中黑暗培养2天，再放入25光照培养箱培养，两个星期后将幼苗分为两部分一部分无菌烟草幼苗的转接到分别含0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/L的1/2MS培养基上盐胁迫处理30天，观察表型；将另一部分野生型烟草与转基因烟草种在含1/2MS的锥形瓶，光照培养箱中培养30天，再经过两天的炼苗后栽培到经过高压灭菌的土蛭石11的营养土里，做好编号，放入H光照和16H黑暗的培养间里培养，统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间。1252CTAB法提取T2代转基因烟草的DNA进行的分子检测（1）取烟草的叶片约1CM2，用研磨
17、棒充分研磨后，每管加入700LCTAB提取缓冲液，65水浴30MIN，期间震荡35次；加入等体积的氯仿，剧烈震荡之后，12000RPM，室温离心10MIN；取上清，加入2倍体积的异丙醇，20放置2小时，12000RPM，室温离心10MIN；弃上清，加入05ML70的乙醇洗涤两次，待充分吹干后加入50LDEPCH2O溶解DNA，20保存。（2）PCR扩增时，以叶片的DNA为模板，在20L的反应体系中加入DNA模板2L，10PCRBUFFER2L，DNTPMIX25MMEACH2L，正反向引物GBMFT2F/GBMFT2R，见表210M05L，02ULRTAQDNA聚合酶，DDH2O补齐。PCR反
18、应程序为94，2MIN，后9440S，5540S，7245S，35个循环后72延伸10MIN。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1253分析不同浓度NACL对T2代转基因烟草叶片叶绿素含量的变化（1）烟草叶片的盐胁迫处理称取新鲜样品02G左右，擦净组织表面污物。分别放入0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/LNACL的溶液中。至于光照培养间，放置72H。（2）测定叶绿素A和叶绿素B的含量将72H盐处理后的叶片剪碎，分别放入研钵中，加少量石英砂和2ML95乙石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化10醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置35
19、MIN。取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ML棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ML，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1CM的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665NM、649NM下测定吸光度。将测定得到的吸光值代入下面的式子CA1395A665688A649；CB2496A649732A665。据此即可得到叶绿素A和叶绿素B的浓度（CA、CBMG/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织
20、中叶绿素的含量叶绿素的含量（MG/G）叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重。1254统计不同浓度NACL对T3代转GBMFT2基因烟草种子萌发率的影响将转基因烟草种子在70酒精消毒2MIN，再加入20NACLO消毒7MIN，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/LNACL的MS培养基上。至于暗培养箱中暗培养2天，再放入25光照培养箱培养，统计种子的萌发率。1255分析不同浓度NACL对T3代转基因烟草幼苗的影响将T3代转GBMFT2基因烟草种子和野生型烟草种子消毒处理，方法见1254。将T3代转GBM
21、FT2基因烟草种子点种在含200MG/LKAN的MS筛选培养基，将野生型烟草种子点种在MS培养基。置于黑暗培养箱中暗培养2天，再放入25光照培养箱培养。待烟草长出2片子叶，将转GBMFT2基因烟草和野生型烟草分别移栽到含有0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/LNACL、400MMOL/LNACL的MS培养基上，统计烟草植株的根长，13天时再次测量烟草植株的根长。2结果与分析21GBMFT2基因的生物信息学分析211海岛棉中成花素的类似基因GBMFT2编码的CDNA序列长度为747BP，含一长度为519BP的最大ORF，5UTR为75BP，推测ORF编码172
22、个氨基酸。在NCBI上对海岛棉GBMFT2保守域分析表明GBMFT2蛋白含有磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEBP保守结构域（图21），GBMFT2蛋白在羧基末段都含有保守的脯氨酸残基，且在GBMFT2蛋白的第95位为谷氨酸，说明GBMFT2可能属于MFTLIKE家族中的A亚家族。石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化11图21GBMFT2蛋白的磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEBP保守结构域212利用软件PROTSCALE分析预测GBMFT2蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性。多肽链第168位的缬氨酸V具有最低的分值2511，有较高的亲水性。第120位的苯丙氨酸F具有最高的分值1744，有较
23、高的疏水性。可认为棉花的GBMFT2蛋白可能是亲水性蛋白，不符合跨膜蛋白的特征（图22）。图22棉花GBMFT2蛋白的疏水性/亲水性预测213FT、TFL1、MFT蛋白序列的比对及分析植物的PEBP家族基因分为FTLIKE，MFTLIKE和TFL1LIKE三个亚家族。比对分析表明GBMFT2和ATMFT蛋白的相似性为619。拟南芥PEBP家族含有6个成员ATFTGENBANK登录号AAF039361、ATTFL1GENBANK登录号AAB416241、TSFGENBANK登录号AAF030371、MFTGENBANK登录号AAD373801、BFTGENBANK登录号Q9FIT41及ATCGE
24、NBANK登录号BAA759311与本研究克隆的棉花GBMFT2、已报道的棉花GHFTL1、GHTFL1A和GHTFL1B的氨基酸序列比对分析发现（图23），GBMFT2蛋白含有FT/TFL1家族中都存在的DPDXP和GXHR结构域，用色氨酸TRP和丙氨酸ALA残基取代了FT亚家族中关键的络氨酸TYR和谷氨酰胺GLN残基。在GBMFT2蛋白羧基末段存在一个保守的脯氨酸残基，而这个脯氨酸残基只在MFTLIKE基因家族发现，而在FTLIKE和TFL1LIKE基因家族中至今还石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化12没有发现类似的保守氨基酸残基，脯氨酸被认为具有改变蛋白质结构
25、的能力。ADPDXP基序；B区分FT/TFL1的关键氨基酸络氨酸TYRY/HISH；CB亚家族中的保守谷氨酸GLUE，DGXHR基序，EFT/TFL1家族蛋白羧基端保守基序；F大多数MFTLIKE中保守的普氨酸PROP。图23FT、TFL1、MFT蛋白家族比对分析214海岛棉GBMFT2蛋白系统进化分析从GENBANK数据库中下载来自30物种的FTLIKE、MFTLIKE、TFL1LIKE三个亚家族蛋白（表21），比较其编码的氨基酸序列，利用蛋白质序列构建系统进化树（图24），这些FT/TFL1家族蛋白中本研究中的GBMFT2与葡萄VVMFT蛋白，番茄SP2I蛋白距离较近，都属于MFTLIKE
26、家族。表21进化树中各基因的物种信息及其蛋白质在GENBANK登录号编号基因物种拉丁名物种名蛋白登录号1GBMFT2GOSSYPIUMBARBADENSE海岛棉2GBMFT1GOSSYPIUMBARBADENSE海岛棉KC5137443GBFTL1GOSSYPIUMBARBADENSE海岛棉AEW244441石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化134GHFTL1GOSSYPIUMHIRSUTUM陆地棉ADK9511315GHTFL1AGOSSYPIUMHIRSUTUM陆地棉ABW2496316GHTFL1BGOSSYPIUMHIRSUTUM陆地棉ABY6277017C
27、IFTCITRUSUNSHIU温州蜜柑BAA7783618FCFTFICUSCARICA无花果BAI6005219CSFTCUCUMISSATIVUS黄瓜BAH28253110PMFTPRUNUSMUME梅花CAQ16124111CPFTCARICAPAPAYA番木瓜ACX85427112VVFTVITISVINIFERA葡萄ABF56526113CLFTCHRYSANTHEMUMLAVANDULIFOLIUM甘菊ACY82397214HD3AORYZAGLUMIPATULA水稻BAH56285115RFT1ORYZASATIVAJAPONICAGROUP水稻BAJ53917116OSMFT2
28、ORYZASATIVAJAPONICAGROUP水稻组BAG98997117PNFT1IPOMOEANIL牵牛花ABW73562118PNFT2IPOMOEANIL牵牛花ABW73563119BVFT1BETAVULGARIS甜菜ADM92608110BVFT2BETAVULGARIS甜菜ADM92610121BVCEN1BETAVULGARIS甜菜ADM92611122BVMFT1BETAVULGARIS甜菜ADM92616123MDCENAMALUSXDOMESTICA苹果BAG31957124MDFT2MALUSXDOMESTICA苹果BAI77728125MDCENBMALUSXDOM
29、ESTICA苹果BAG31958126MDTFL1MALUSXDOMESTICA苹果BAD06418127MDFT1MALUSXDOMESTICA苹果BAI77730128SPSOLANUMLYCOPERSICUM番茄AAC26161129SP9DSOLANUMLYCOPERSICUM番茄AAO31795130SP3DSOLANUMLYCOPERSICUM番茄AAO31792131SP2GSOLANUMLYCOPERSICUM番茄AAO31791132ATTFL1ARABIDOPSISTHALIANA拟南芥AED906611石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化1433
30、ATCARABIDOPSISTHALIANA拟南芥AEC08014134ATMFTARABIDOPSISTHALIANA拟南芥AEE29676135TSFARABIDOPSISTHALIANA拟南芥AEE84314136TSFARABIDOPSISTHALIANA拟南芥AEE84314137RCN1ORYZABRACHYANTHA野生稻CBX25328138RCN2ORYZABRACHYANTHA野生稻BAH01422139AMCENANTIRRHINUMMAJUS金鱼草CAC21564140PTCENL1POPULUSTRICHOCARPA毛果杨AAQ88444141STTFL1SOLANU
31、MTUBEROSUM马铃薯ABC24691142TAMFTTRITICUMAESTIVUM小麦BAK78908143HVMFT1HORDEUMVULGARESUBSPVULGARE大麦BAH24198144CUMFT1CITRUSUNSHIU温州蜜柑BAF93494145PAMFT1PICEAABIES挪威云杉AEH59565146PAMFT2PICEAABIES挪威云杉AEH59566147AHMFTARACHISHYPOGAEA花生AFP33419148VVMFTVITISVINIFERA葡萄ABI99469149PNFTL4APOPULUSNIGRA钻天杨BAG12904150PTMFT
32、POPULUSTRICHOCARPA欧洲大叶杨ABC26020151ZEN9ZEAMAYS玉米NP_001106248152ZEN10ZEAMAYS玉米NP_001106249153ZCN9ZEAMAYS玉米ABX11011154LSFTLACTUCASATIVA莴苣BAK14369155CSTFLCITRUSSINENSIS甜橙AAR046831石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化15MDFT1PMFTMDFT2CSFTCPFTVVFTFCFTGHFTL1PNFTL4AHD3ARFT1CLFTLSFTCIFTSP3DBVFT1BVFT2PNFT1PNFT2TSFAT
33、TFL1MDTFL1SP9DCSTFLGHTFL1BRCN1RCN2BVCEN1PTCENL1GHTFL1AMDCENAAMCENSPSTTFL1PAMFT1PAMFT2GBMFT2VVMFTSP2GBVMFT1GBMFT1PTMFTCUMFT1AHMFTATMFTTAMFTHVMFT1OSMFT2ZEN10ZCN9ZEN9999999997644369899379995519258662999685374315422314441559999999494695299242047262261140258418005图2454个植物PEBP蛋白家族系统进化分析MFTLIKECLADETFL1LIK
34、ECLADEFT1LIKECLADE石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化16215GBMFT2编码蛋白三维结构的预测与分析利用同源建模法，构建和分析GBMFT2蛋白质的三维结构（图24）。发现GBMFT2蛋白与拟南芥的FT/TFL1家族蛋白的三级结构十分类似。GBMFT2蛋白含有5个反向平行的肽链形成一个大的中心折叠片，还有连接在两侧的1个较小的折叠片，形成一个桶装结构。GBMFT2蛋白整体三维结构，螺旋状代表SHEET，其它线性骨架为无规卷曲图25同源建模法构建的GBMFT2蛋白质三维结构23叶盘法转化烟草转化通过叶盘法将GBMFT2基因转入野生型烟草植株中，经过烟
35、草叶片的预培养、共培养、筛选培养，对在生根培养基上可正常生根生长的烟草植物（图26）进行PCR检测，结果发现P35SGBMFT2转化进入烟草植株中，有7株转化成功图27。、A选择培养B愈伤组织的形成C诱导愈伤形成丛芽D丛芽诱导生根图26烟草的遗传转化A石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化17M分子量MARKER，DL2000，1泳道为阳性对照，11泳道为野生型烟草对照，29泳道为转基因植株，10泳道为阴性对照图27T1代转P35SGBMFT2基因烟草植株的PCR鉴定24统计T1代转基因烟草的开花时间从烟草种到营养土中到开第一朵花，统计烟草的开花时间表22，由于烟草株数
36、较少，统计分析得转基因烟草与野生型烟草开花时间没有明显的区别。表22T1代不同的GBMFT2转基因株系及野生型烟草的开花所需时间基因型株系世代光照植株数目开花所需时间WT1短日照1612短日照155P35SGBMFT21T1短日照1442T1短日照1473T1短日照1484T1短日照1695T1短日照1546T1短日照1497T1短日照15825棉花GBMFT2基因在ABA胁迫下的表达分析在含0MOL/L、05MOL/L、1MOL/L、5MOL/L、10MOL/LABA的MS培养基处理棉花种子20H，半定量RTPCR实验结果表明，在棉花种子萌发的过程中，GBMFT2的表达量会随着ABA浓度的增
37、加而升高（图28）。A10MOLL1205MOLL131MOLL145MOLL1510MOLL1ABA石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化18图28ABA胁迫下棉花种子的GBMFT2基因的表达检测26T2代转基因烟草耐盐性分析先用含200MMG/L卡那霉素的1/2MS培养基筛选转基因烟草种子，在烟草长到2片子叶时分别在100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/L的NACL胁迫1/2MS固体培养基中处理经转基因烟草幼苗和野生型烟草幼苗30天。结果显示在200MMOL/L、300MMOL/L盐胁迫下转基因烟草比野生型烟草的株型大，表现出耐盐特性（图29）。A
38、、B、C、D分别代表在0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/L浓度的NACL中转基因烟草与野生型烟草的表型（红色箭头指向的野生型烟草）图29盐胁迫30天27T2代转基因烟草的分子检测电泳检测PCR产物，表明T2代13株转GBMFT2烟草都为转基因烟草植株（图210）。1分子量MARKER，2泳道为阳性对照，3泳道为野生型烟草对照，17泳道为阴性对照，416泳道为转基因植株图210T2代转P35SGBMFT2基因烟草植株的PCR鉴定ADBC石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化1928盐胁迫下T2代转基因烟草叶绿素A和叶绿素B的总量将T2
39、代转基因烟草和野生型烟草相同部位的烟草叶片置于0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、30MMOL/LNACL的溶液中浸泡72H图213。测定不同浓度下烟草的叶绿素A和叶绿素B总量的变化（图214），在100MMOL/L、200MMOL/LNACL溶液胁迫下转基因烟草的叶绿素总量的高于野生型烟草。表明在盐胁迫下转基因烟草的光和系统受盐胁迫的影响较小。图211烟草叶片盐胁迫处理图212叶绿素A、叶绿素B总量的变化29统计T2代转P35SGBMFT2基因烟草植株的开花时间从烟草种到营养土中到开第一朵花，统计短日照下烟草的开花时间表23，转基因烟草的开花时间晚于野生型烟草（图213）
40、。表23T2代不同的GBMFT2转基因株系及野生型烟草的开花所需时间编号栽培日期开花日期开花时数（天）野生型12013/10/172013/03/08172野生型12013/10/172013/03/06170野生型12013/10/172013/03/06170石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化20野生型12013/10/172013/03/02166野生型12013/10/172013/03/05169野生型12013/10/172013/03/07171L112013/10/172014/04/08202L122013/10/172014/04/12206L1
41、32013/10/172014/04/13207L142013/10/172014/03/10174L252013/10/172014/03/23187L262013/10/172014/04/08202L272013/10/172014/04/08202L382013/10/172013/03/18182L392013/10/172013/03/18182L3102013/10/172013/03/25189L3112013/10/172013/04/10204L3122013/10/172013/03/25189L3132013/10/172013/04/09203图212T2代转GBMF
42、T2基因株系和野生型烟草的开花所需时间210T3代转GBMFT2基因烟草种子在盐胁迫下的萌发率。在0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/LNACL胁迫20天，只有在0MMOL/LNACL的MS培养基烟草萌发，其他浓度盐胁迫处理下的烟草都未萌发（图213）。（再做一次实验，合理设置NACL的浓度）。石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化21A、0MMOL/LNACL的MS培养基B、100MMOL/LNACL的MS培养基图213盐胁迫下T3代转GBMFT2基因萌发率分析211盐胁迫对T3代转GBMFT2基因烟草根长的影响将KAN筛选后的烟草
43、分别种在0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/L、400MMOL/LNACL的MS培养基上，盐胁迫20天（图214）时，在0MMOL/LNACL的MS培养基中野生型烟草与转GBMFT2基因烟草的长势没有明显区别（图214A），但在300MMOL/L、400MMOL/LNACL的MS培养基上转GBMFT2基因烟草的叶片明显比野生型烟草的大（图214D、E），分别测量烟草根长发现在100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/L、400MMOL/LNACL的MS培养基中转GBMFT2基因烟草的根长平均增长量大于于野生型烟草根长平均增长量（图1215、图1
44、216）。ABABCDE石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化22A、B、C、D分别代表在0MMOL/L、100MMOL/L、200MMOL/L、300MMOL/L、400MMOL/LNACLMS培养下的烟草，每培养基中第一行是野生型烟草，第二、三行分别是转GBMFT2烟草L1和L2。图1214盐胁迫前，后烟草幼苗图1215盐胁迫后烟草幼苗ADCBE石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化23图1216盐胁迫后烟草幼苗高度增长值3、讨论与结论31讨论PEBP家族蛋白是植物中存在的一类分子量较小序列相对保守的家族蛋白，分为3个亚家族MFTLIKE、F
45、TLIKE和TFL1LIKE。对该基因家族中功能研究较为清楚的是FT和TFL1基因，二者蛋白的氨基酸序列高度相似，但FT起着促进开花的作用,而TFL1却是开花抑制基因8。研究认为，MFT是FT和TFL1的祖先，早在地钱和苔藓植物中就已经含有MFT基因，而FT和TFL1基因出现在石松门分化以后10。在双子叶植物如拟南芥、番茄、葡萄和杨树中,PEBP家族的基因为69个。PEBP的家族成员数量在单子叶植物中大约是双子叶植物的34倍，在水稻、小麦和玉米中分别有至少19、20和24个，且分布也不同。如拟南芥的TFL1LIKE、MFTLIKE和FTLIKE亚家族基因的数量比例为312，水稻中为4213，玉
46、米中为631516。成花素在植物中的运输机制，在水稻和拟南芥中有较好的研究，而棉花成花素的研究却很少，顾超等从棉花中克隆出在B亚家族的MFT基因GBMFT113，在刚萌发的种子中表达量高，用不同浓度的ABA处理的种子中表达变化不明显，表明GBMFT1基因的表达不受ABA的调节。过表达GBMFT1的烟草植株表现出提前开花的表型13。在苔藓植物中，MFT基因与孢子体的发育有关16，说明MFT可能也与植物的受精作用有关。另外，葡萄VVMFT的表达类似于VVFT的表达，它可能是葡萄中的开花促进因子。本研究分析了GBMFT2基因的功能氨基酸比对分析表明，该基因编码的蛋白包含FTLIKE和TFL1LIKE
47、亚家族的保守基序，并且在羧基末段含有只在MFTLIKE家族中含有的保守氨基酸脯氨酸；系统进化树分析表明GBMFT2编码产物与葡萄VVMFT蛋白，番茄SP2I蛋白距离较近，属于MFTLIKE家族的A亚家族；不同浓度ABA的胁迫诱导表明GBMFT2基因受ABA的胁迫诱导；转GBMFT2基因的烟草开花晚于野生型烟石河子大学本科毕业论文海岛棉GBMFT2基因在烟草中的遗传转化24草；转GBMFT2基因的烟草耐盐性也强于野生型烟草，说明开花与耐盐之间也许存在着某些通路，有待进一步研究。到目前为止，虽然对MFT基因进行了一定量的研究，但仍然存在很多问题有待深入研究，现就MFT基因的研究趋势进行预测。MFT
48、基因在草本植物与木本植物、一年生与多年生植物、两性花与单性花之间的表达及功能存在哪些差异；MFT基因在不同的组织、器官中表达量不同，MFT基因是怎么样调控表达的，MFT基因启动子是诱导型启动子还是组织特异性启动子，这种启动子又是如何调控MFT基因表达的；基因MFT转录本或蛋白是否从叶传输到茎顶端分生组织的；如果MFT蛋白是与其他蛋白结合成蛋白复合体，那么蛋白又是哪一种或多种，这种蛋白复合体是怎样影响花芽发育的；有些植物中同一个植物体内含有多个MFT同源基因，它们之间又是如何分工协作的；MFT基因又是如何与上游基因以及下游基因进行联系决定开花诱导的；还有MFT基因是怎样应答逆境如盐胁迫的。通过转
49、基因烟草分析，表明棉花成花素基因GBMFT2具有调控植物开花的作用，并且能抑制开花，并且GBMFT2基因能够使烟草相应盐胁迫。对棉花MFT同源基因的分离和功能分析对研究成花的机制以及通过基因工程手段调控棉花的开花时间，避开秋后低温对棉花的影响，从而提高棉花的产量和棉花纤维品质具有重要的指导理论意义，若成花素基因导入到花卉植物中，通过调控成花素基因的表达量来控制花卉植物的生长周期，可能培育出在不同株高、不同季节都可以开花的植株，从而提高观赏性，以及克服季节性开花的缺点，增加花卉市场的竞争力，如将该基因转到盐碱地农作物中，将提高农作物的产量。此外，该基因与耐盐性有关，可以进一步研究其耐盐机理以及盐胁迫与植物发育之间的关系。32结论321NCBI上对海岛棉GBMFT2保守域分析表明GBMFT2蛋白含有磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEBP保守结构域。322GBMFT2蛋白含有FT/TFL1家族中都存在的DPDXP和GXHR结构域，用色氨酸TRP和丙氨酸ALA残基取代了FT亚家族中关键的络氨酸TYR和谷氨酰胺GLN残基。在GBMFT2蛋白羧基末段存在一个保守的脯氨酸残基，而这个脯氨酸残基只在MFTLIKE基因家族发现，而在FTLIKE和TFL1LIKE基因家族中至今还没有发现类似的保守氨
