1、专题 2 微生物的培养与应用 第 5 课时 微生物的实验室培养 目标导航 1.了解有关培养基的基础知识，掌握无菌操作技术的有关内容。2.了解消毒和 灭菌常用的方法及二者的区别。3.学会以大肠杆菌为材料进行微生物培养与分离纯化的方 法。 一、培养基与无菌技术 1培养基 (1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其 _ 的_。 (2)成分：一般含有_、_、_、_ ，此外还要满足微生物对 _(即生长因子 )、_以及氧气的需求。 拓展深化 营养物质 定义 作用 主要来源 碳源 能提供所需_的物质 构成生物体的_ 和一些_，有些 是异养生物的_ 无机化合物： CO2、NaHCO3 等；有 机化合
2、物：糖类、脂肪 酸、花生粉饼、石油等 氮源 能提供所需_的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物： N2、NH3、铵盐、硝酸 盐等；有机化合物：尿 素、牛肉膏、蛋白胨等 特殊营养物 质(生长因子) 生长必不可少的 _ 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基 等 水 在生物体内含量很高， 在低等生物体内含量更 高 不仅是优良的溶剂，而 且可维持生物大分子结 构的稳定 无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素 细胞内的组成成分，生 理调节物质，某些化能 自养菌的能源，酶的激 活剂 (3)培养基的种类 划分标准 培养 基种 类 特点 用途 _ _培 养基 _来源: 来源: ww
3、w.shuli 来源: 物理性质来源: www.shuli 来源: 来源: www.shuli 来源: 半固 加凝固剂，如琼脂来源: www.sh 观察微生物的运动、分类、 体培 养基 鉴定 _ _培 养基 微生物_、_、活菌 计数、 保藏菌种 _ _培 养基 含化学成分不明确的 天然物质 工业生产化学 成分 _ _培 养基 培养基成分明确(用化学 成分已知的化学物质配 成) 分类、鉴定 _ _培 养基 培养基中加入某种化学 物质，以_不需要的 微生物的生长，_所 需要的微生物的生长 培养、_出特定微生物 (如培养酵母菌和霉菌，可 在培养基中加入青霉素或 链霉素；培养固氮菌可用 无氮培养基，如
4、阿须贝培 养基)用 途 _ _培 养基 根据微生物的代谢特点， 在培养基中加入某种指 示剂或化学药品 _不同种类的微生物， 如可用伊红美蓝培养基 鉴别饮用水或乳制品中是 否有大肠杆菌(若有，菌落 呈深紫色，并带有金属光 泽) 注意 病毒目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动、植物组织细胞中才能繁殖。常 用于培养病毒的是活鸡胚。 2无菌技术 (1)概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为 无菌技术。 注意 在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是 _，_。 (2)无菌技术的具体内容 对实验操作的_、操作者的_进行清洁和消毒。 将用于微生物培养的_、接种用具和
5、培养基等进行_。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在_进行。 实验操作时应避免已_处理的材料用具与周围的物品相接触。 (3)消毒和灭菌的概念 消毒：消毒是指使用_的物理或化学方法杀死物体表面或内部的 _(不包括芽孢和孢子 )。 灭菌：灭菌是指使用_的理化因素杀死物体内外_，包括 _。 消毒与灭菌的区别：两者最大的区别是_。 拓展深化 某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形的抗逆性休眠体，称为 芽孢。每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射 、抗 化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。 孢子是微生物产生的一种有
6、繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适 应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。 (4)消毒与灭菌的常用方法 方法 条件 作用对象 _ _ 100，煮沸 56 min 杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢 _ _ _ 7075煮 30 min 或 80煮 15 min 不耐高温的液体 70%的酒精 对双手消毒 50%的石炭酸、来苏水 对空气消毒 _ _ _ 一定浓度的乳酸、食醋 通过熏蒸对空气进行消毒 消 毒 紫外 线法 紫外线照射 30 min 物体表面或空气中的微生物 _ _ 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 对接种环、接种针或其他金属工具灭
7、菌， 也可以对试管口、瓶口灭菌 _ _ 在干热灭菌箱内，160170条件 下，加热 12 h 耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器 皿和金属用具等 _ _ _ 在高压蒸汽灭菌锅内，121，100 kPa，灭菌 1530 min 灭 菌 _ _ _ 30 W 照射 30 min 小型接种室、接种箱等 二、实验操作 (一)配制培养基 1配制原则 (1)_(根据微生物的种类、培养目的等 )，如培养基可由简单的无机物组成；生 产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化 学成分的物质。 (2)_，注意各种营养物质的浓度和比例。 (3)_，各种微生物适宜生长的 pH 范围
8、不同，细菌 6.57.5、放线菌 7.58.5、 真菌 5.06.0。 注意 不同微生物对营养需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性 强的培养基。 营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用，另外， 培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳 氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为 41 时， 菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为 31 时，菌体繁殖受抑制，但谷 氨酸合成量大增。 2配制方法(以制备牛肉膏蛋白胨固体培养基为例 ) (1)培养异养菌的牛肉膏蛋白胨固体培
9、养基的营养构成 培养基组分 提供的主要营养物质 牛肉膏 5.0 g 碳源、磷酸盐和维生素 蛋白胨 10.0 g 氮源和维生素 NaCl 5.0 g 无机盐 H2O 定容至 1 000 mL 氢元素、氧元素 (2)实验流程 提醒 合格的培养基必须灭菌效果好。培养基配制好后，要放在恒温箱中保温 12 d，若 无菌落生长则说明制备的培养基是合格的。 (二)纯化大肠杆菌 纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来 自于一个大肠杆菌的分裂，即这个菌落的细菌群体由一个大肠杆菌繁殖而来，这就需接种 时尽量接种单个的大肠杆菌。 1微生物接种的方法 微生物接种的方法最常用的是
10、_和_两种。 (1)_通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀 释分散到培养基的表面。 将_放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红。 在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的_。 将试管口通过酒精灯的_。 将已冷却的接种环伸入菌液中，_一环菌液。 将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞。 _将培养皿皿盖打开一条缝隙，_将沾有菌种的接种环迅速伸入 _，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。 灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操 作，在三、四、五区域内划线。注意不要将_的划线与_相连。 将_，放入培养箱中培养。 (2)_则
11、是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂 布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 系列稀释操作 a取盛有 9 mL 水的 6 支试管灭菌，并按 101106 的顺序编号。 b用_吸取 1 mL 培养的菌液，注入 101 倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的 橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。 c从 101 倍稀释的试管中吸取 1 mL 稀释液，注入 102 倍稀释的试管内吹吸均匀，获得 102 倍液。依此类推。 涂布平板操作 a将_浸在盛有酒精的烧杯中。 b取不超过 0.1 mL 的_，滴加到培养基表面。 c将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810 s
12、。 d用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。 2注意事项 (1)平板划线法 操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行_，划线操作结束 时，仍需灼烧_。 从第二次以后的划线操作总是从_开始，能使细菌的数目随着划线次数 的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 (2)稀释涂布平板法 稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“_” ，应特别注意： 酒精灯与培养皿的距离要合适。 吸管头不要接触任何其他物体。 吸管要在酒精灯火焰周围使用。 3微生物分离纯化培养的结果作出分析与评价 (1)培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不
13、彻底。 (2)在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。 (3)培养 12 h 和 24 h 后的菌落大小不同，菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细 菌繁殖越多，菌落体积越大，而菌落的位置不动，只是菌落数增多。 (4)频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固 体斜面培养基培养后，保存在 4冰箱中，第 36 个月转种培养一次，缺点是保存时间较 短，菌种容易被污染或产生变异；后者将菌种与无菌甘油等量混合后保存在20的冷冻 箱中。 4菌种的保存 为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用 _法；对于需要长期
14、保存的菌种，可以采用_法。将菌种 放在低温环境中保藏的目的是_，但时间长了菌种还是要老化的， 因此对临时保存的菌种_个月后需重新接种。 知识点一 培养基与无菌技术 1不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以 CO2 为唯一碳源的自养微 生物营养的描述中，不正确的是( ) A氮源物质为该微生物提供必要的氮素 B碳源物质也是该微生物的能源物质 C无机盐是该微生物不可缺少的营养物质 D水是该微生物的营养要素之一 2下列说法正确的是( ) A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 C除水以外的无机物只能提供无机盐 D无机氮源不可能提供能量 知识点
15、二 大肠杆菌的纯化培养 3有关平板划线操作的叙述，不正确的是( ) A第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上的菌种 C在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液 D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操 作者 4下列为某同学在培养金黄色葡萄球菌实验中的部分操作步骤，其中正确的是( ) A培养基中蛋白胨、牛肉膏溶化后，直接补充蒸馏水至 100 mL B培养基配制完毕可直接使用 C加压至 100 kPa 之前，要彻底排出锅内的冷空气 D将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，灭菌后立即
16、伸入菌液试管内挑取少量菌种 一、选择题 1关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，叙述错误的是( ) A操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 B将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯 C待培养基冷却至 50左右时进行倒平板 D待平板冷却凝固约 510 min 后，将平板倒过来放置 2金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒，下述实验结 束后的做法错误的是( ) A对接种环进行灼烧处理 B带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉 C带菌培养基必须经加热后才能倒掉 D接种后双手必须经肥皂洗净，再用 75%的酒精棉球擦拭 3防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前
17、提。下列叙述错误的是( ) A实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒 B接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌 C在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染 D使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境 4下列叙述错误的是( ) A右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近 B倒平板整个过程应在火焰旁进行 C打开培养皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 D为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置 5有关稀释涂布平板法的说法中，错误的是( ) A用移液管把菌液从一支试管转移到下一
18、支试管后，要用手指轻压移液管的橡皮头，吹 吸三次，目的是使菌液与水充分混匀 B移液管需经过灭菌 C试管口与移液管应在离火焰 12 cm 处 D涂布时可转动涂布器，使菌液涂布均匀 6以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序正确的是( ) A计算称量倒平板溶化 灭菌 B计算称量溶化倒平板 灭菌 C计算称量溶化灭菌 倒平板 D计算称量灭菌溶化 倒平板 7为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( ) A对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法 B临时保藏的菌种一般是接种到试管的斜面培养基上 C临时保藏的菌种容易被污染或产生变异 D对于需要长期保存的菌种，可以采用低温 4保
19、藏的方法 8有关平板划线操作的叙述，正确的是( ) A使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌 B打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞 C把皿盖打开，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可 D最后将平板倒置，放入培养箱中培养 二、简答题 9某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实 验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各 种食用菌菌种。请回答下列问题： (1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养 基所需的原料：_、_、_、_、_。其中提供氮
20、源的 是_；提供碳源的主要物质是_。 (2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，故配制培养基时各成分要有合适的 _。在烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止_。 (3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧 放入_中灭菌，压力_kPa，温度_，时间_。灭菌完 毕拔掉电源，待锅内压力自然降到 0 时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管 _。 (4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入_，把锅内水加热煮沸并将其中原有 冷空气彻底排出后将锅密闭。 (5)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯_(“ 内”或“外”)焰灭菌， 并且待接种环_后蘸取菌
21、种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管放入 _冰箱中保藏。 10下表是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的牛肉膏蛋白胨培养基的配方。请回答： 试剂 用量 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂 20.0 g 水 1 000 mL (1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机 盐。上述培养基配方 中能充当碳源的成分是_和_。培养基配制完成以后，一般还要调节 pH 并 对培养基进行_处理。 (2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是_和 _两种。在接种过 程中，接种针或涂布器的灭菌方法是_。 (3)假设某同学发现培养基上细菌数目过多地连成一片，可能
22、的原因是什么？ _。 第 5 课时 微生物的实验室培养 知识清单 一、1.(1)营养物质 生长繁殖 营养基质 (2)水 无机盐 碳源 氮源 特殊营养物质 pH 拓展深化 碳元素 细胞物质 代谢产物 能源物质 氮元素 微量有机物 (3)液体 固体 工业生产 分离 鉴定 天然 合成 选择 抑制 促进 分离 鉴别 鉴别 2(1)防止杂菌污染 保证培养的纯度 (2) 空间 衣着和手 器皿 灭菌 酒精灯 火焰附近 灭菌 (3) 较温和 部分微生物 强烈 所有的微生物 芽孢和孢子 芽孢和孢子是否存活 (4)煮沸法 巴氏消毒法 化学药剂法 灼烧灭菌 干热灭菌 高 压蒸汽灭菌 紫外线灭菌 二、(一)1.(1)
23、目的要明确 (2)营养要协调 (3)pH 要适宜 2.(2)计算 称量 溶化 调节 pH 分装 灭菌 倒平板 (二)1.平板划线法 稀释涂布平板法 (1)平板划线法 接种环 棉塞 火焰 沾取 左手 右手 平板内 最后一区 第一区 平板倒置 (2)稀释涂布平板法 移液管 涂布器 菌液 2(1)火焰灼烧灭菌 接种环 上一次划线末端 (2)无菌 4临时保藏 甘油管藏 降低微生物的新陈代谢速率 36 对点训练 1B 对于 CO2 来说，它为无机物，只能做碳源而不能作为能源物质。 规律链接 微生物代谢类型与营养的关系： 营养型微生物 碳源 氮源 生长因子 举例 自养型微生物 CO2、NaHCO3 NH3
24、、铵盐、硝酸盐等 一般不需要 硝化细菌 异养型微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些种类需要 乳酸菌 2.A 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体 培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如 NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供 能量，如 NH3 可以为硝化细菌提供能量。 3C 在第二区域内划线时，接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。 规律链接 (1)无菌技术是微生物培养中的关键环节。掌握无菌技术操作的方法及所适用的 条件。时刻建立“有菌” 观念，注意操作中的合理
25、灭菌，以杜绝或防止杂菌污染。 (2)平板划线法和稀释涂布平板法都要求最终形成标准菌落。因此，划线或稀释要充分，如 果培养基上长出的菌落相互重叠，则说明划线或稀释不充分，应该重新操作。 4C 培养基的配制应该先加水，后加热溶化，否则培养基会被烧焦；培养基配制完毕要 经过灭菌后才能使用；在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽， 当压力上升到 100 kPa 时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底；接种 时，接种环放到酒精灯火焰上灼烧灭菌是应该的，但不能立即伸入菌种试管内，否则会将 菌种烫死。 达标测试 1A 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、
26、倒平板，不能 颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培 养基冷却至 50，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时，进行倒平板。 平板冷却 510 min 后还需倒置。 2C 金黄色葡萄球菌有很强的致病力，所以在操作时一定要做到安全防范，接种后双手 用肥皂洗净，再用 75%的酒精棉球擦拭，以起到杀菌的作用；对接种环进行灼烧也可以杀 灭细菌，防止污染环境；高压蒸汽灭菌也可杀死培养基中的金黄色葡萄球菌；如果只对带 菌培养基进行加热，杀不尽其中的致病菌，因为此菌的耐高温能力很强，会污染环境。 3B 对接种环等金属用具进行灼烧灭菌，应放在酒精灯火焰的充分
27、燃烧层即外焰处。 4C 5.D 6.C 7D 对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在 3 mL 甘油瓶中加入 1 mL 甘 油后灭菌，将 1 mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20的冷冻 箱中保存。 8D 平板划线操作时要时刻注意两个问 题：一是防止杂菌污染；二是要尽可能地将菌 种分离。 9(1)牛肉膏 蛋白胨 水 无机盐 琼脂 蛋白胨 牛肉膏 (2) 比例 搅拌 琼脂糊底 引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 100 121 1530 min 废弃 (4)适量水 (5) 外 冷却 4 10(1)牛肉膏 蛋白胨 灭菌 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 蘸取酒精；引燃灭
28、菌 (3)菌液浓度过高；培养过程中被 杂菌污染；利用接种针划线时，划下一个区域前没有对接种针进行灭菌处理 解析 牛肉膏和蛋白胨都是从天然物质中提取出来的，都含有丰富的有机物，可以为微生 物提供碳源和氮源。平板划线法和稀释涂布平板法都能使菌体分散开，但如果操作不当， 会使分离效果不理想。 第 6 课时 土壤中分解尿素细菌的分离与计数 目标导航 1.研究培养基对微生物的选择作用。2.进行微生物数量的测定。 一、研究思路 1筛选菌株 (1)实验室中微生物筛选的原理 人为提供有利于_生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时_或 _其他微生物生长。 (2)选择培养基 在微生物学中，将允许_种类的微生
29、物生长，同时_或_其他种类 微生物生长的培养基，称做选择培养基。 (3)分离分解尿素的细菌的选择培养基 在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是_，提供氮源的是 _，琼脂的作用是凝固剂。 该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是_才 能在该培养基上生长。 土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成_，将尿素分解的反应 式是_ _。 Taq 细菌能忍受 93左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明， 在寻找目的菌株时，要根据_。 2统计菌落数目的方法 (1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法 ) 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液
30、中的 _，通过统计平板上的_，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 操作 第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列 10 倍稀释，然后选 择_稀释度的菌液，分别取 0.1 mL 接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将 菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可 将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出_。 第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在_的平板进行计数，若设置的重复组 中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。 计算公式：每克样品中的菌株数 M，其中 C 代表 CV _，V 代表_(mL) ，M 代 表_。
31、(2)显微镜直接计数法 原理：此法利用特定的_或_，在显微镜下计算一定容积的样 品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特 定的面积 1 mm2 和高 0.1 mm 的计数室，在 1 mm2 的面积里又被划分成 25 个(或 16 个) 中 格，每个中格进一步划分成 16 个(或 25 个) 小格，计数室由 _个小格组成。 操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数 45 个中格中 的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。 计数公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。
32、(3)设置重复和对照 设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布_个平板，才能增强 实验的说服力与准确性。 设置对照：实验中应设置对照，主要目的是_对实验结果的影 响，提高实验结果的可信度。如_对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置 _培养基，观察选择培养基是否具有_作用。 二、实验设计 实验步骤 1土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土 3 cm 左右，迅速取土壤 并装入_密封或事先准备好的_中。 2制备培养基：制备_培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基 作为_，用来判断选择培养基是否具有_。 放宽稀释范围，如稀释倍数为 103107 范围内的要分别涂布，而每
33、个稀释度下需要 _个选择培养基、_个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要 15 个选择培养基和 5 个 牛肉膏蛋白胨培养基。 两种培养基应各有一个作为_对照，此外还需准备 8 个灭菌的试管和 1 个灭菌的 移液管。 3样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将 10 g 土样加入盛有 90 mL 无 菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为 250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 1 mL，转移至盛有 _ mL 生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至 107 稀释度，并按照由 107103 稀释 度的顺序分别吸取_mL 进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不 必更换移液管。 说明：图中的 1
34、、2、3 平板是_，4 为_作对照，判断选 择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉 膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否_。 4将涂布好的培养皿放在 30温度下培养，及时观察和记录。 5挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含_培养基的斜面中，观察能否产生 颜色反应。 6细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在_的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出_，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中 细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。 7统计表格 表一 平板上的菌落数记录表 稀释倍数 103 104 105 106
35、 107 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 表二 菌落特征记录表 菌落 形状 大小 隆起 颜色 种类 程度 1 2 3 注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间) ，_表 现出_的菌落特征。 三、操作提示 1取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要_。 2应在_旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入_中，塞好棉塞。 3在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在_ _旁操作。 4实验时要对_做好标记。注明_等。 5为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当_。 四、结果分析与评价 内容 结论分析 有无杂菌污染的 判断 对照
36、的培养皿中_菌落生长未被杂菌污染 培养物中菌落数_被杂菌污染 菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入_ 选择培养基的筛 选作用 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目_选择培养基的数目选择培养基具 筛选作用，已筛选出一些菌落 样品的稀释操作 得到 2 个或 2 个以上菌落数目在_的平板操作成功，能进行菌落的计数 重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应_；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因 五、课题延伸 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_将尿素分解成了_。氨会使培 养基的碱性增强，_升高。因此，我们可以通过检测培养基_来判断该 化学反应是否发生。 在以尿素为唯
37、一氮源的培养基中加入_指示剂，培养某种细菌后，如果 pH 升高， 指示剂将_，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。 知识点一 研究思路 1下表为本课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题。 KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO47H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g 尿素 1.0 g 琼脂 15.0 g 用蒸馏水定容到 1 000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 _。 (2)按物理性质划分该培养基属于_培养基，理由是培养基中含有 _；该类培养基常用于微生物的_等。 (3)由于_， 所以该培养基只能用于能够合
38、成_的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能 够从土壤中筛选出_的细菌。 (4)在微生物学中，将_ _的培养基，称作选择培养基。 2广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的 C4 植物，单位面积产量很高，种 植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精 的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖) 酵母发酵蒸馏 成品(燃料酒精)。 (1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过 筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下： 步骤 1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤 2：制备选择培养基。在基本培
39、养基的基础上，注意_和 _，加琼脂后灭菌，制成固体平板。 步骤 3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。 步骤 4：根据_， 筛选出突变菌。 (2)上述步骤 2、3 和 4 的依据分别是_ _ _。 知识点二 实验设计 3用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为 106 的培养基中， 得到以下几种统计结果，正确的是( ) A涂布了 1 个平板，统计的菌落数是 230 B涂布了 2 个平板，统计的菌落数是 215 和 260，取平均值 238 C涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 21、212 和 256，取平均值 163 D涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 210、
40、240 和 250，取平均值 233 4在本实验操作中对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是( ) A对培养皿仅需注明培养基的种类即可 B一般在使用之后进行标记 C由于试管用的较多，只需对试管进行标记即可 D标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆 一、选择题 1在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌 和放线菌的生长；在培养基中加入 10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培 养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( ) A乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B固氮细菌、大肠杆菌、放线菌 C固氮细菌、霉菌、放线菌 D固氮细菌、金黄色葡萄球
41、菌、放线菌 2请选出下列正确的操作步骤( ) 土壤取样 称取 10 g 土壤，取出加入盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中 吸取 0.1 mL 土壤溶液进行平板涂布 依次稀释至 101、102、103、104、105、106、107 稀释度 A B C D 3在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是( ) A筛选出能分解尿素的细菌 B对分离的菌种作进一步鉴定 C作细菌的营养成分 D如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素 4下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是( ) A防止杂菌污染 B消灭全部微生物 C稀释土壤溶液的过程中必须在火焰旁操作 D灭菌必须在接种前进行 5下列不属于菌种记数方法的是( ) A平板划线法 B稀释涂布平板法 C显微镜检法 D滤膜法 6下列有关配制培养基的叙述中，正确的是( ) A制作固体培养基必须加入琼脂 B加入青霉素可得到乳酸菌 C培养自生固氮
