1、1 LPEMSZYA-43-2011 生活饮用水中耐热大肠菌群、总大肠菌群、 大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 一、实验原理 该革新的检测技术利用分别由大肠菌群 -半乳糖苷酶及大肠杆菌 -葡萄 糖醛酸酶代谢的两种营养剂指示剂:邻硝基苯-D-半乳派喃糖 (ONPG)及甲基香豆基葡糖醛酸苷(MUG),作为 Colilert 试剂的主要碳源。 1、利用大肠菌群细菌能产生 2 半乳糖苷酶分解 ONPG 使培养液呈黄色, 检测大肠菌群; 2、利用大肠埃希氏菌产生 2 葡萄糖醛酸酶分解 MUG 使培养液在波长 366nm 紫外光下产生蓝色荧光,检测大肠埃希氏菌; 3、改变培养温度,可检测耐热大肠菌群。 因为大
2、多数非大肠杆菌属菌类没有这些酶,所以无法在 Colilert 试剂里 生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非大肠杆菌属菌类会受到 Colilert 特殊配方的基质选择性的抑制作用(专利技术)。 二、 仪器和试剂耗材 1、检测设备程控定量封口机 Quanti- Tray Sealer Model 2X 美国 IDEXX; 2、可充电紫外灯,6W,220V,366nm; 3、紫外线防护镜; 4、DST 酶底物法 24 小时 Colilert 试剂 美 程控定量封口机 国 IDEXX; 5、51 孔定量盘(无菌);97 孔定量 盘(无菌) 6、阳性标准比色瓶,阳性 51 孔标准 比色盘; 7、100
3、mL 含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶; 2 MUG试 剂 ( 科 立得 ) 定 量 盘 ( 51孔 或 者 97孔 ) 取 样 瓶 8.记号笔; 9.无菌剪刀; 10.无菌夹子; 11.一次性医用无菌手套。 四、实验步骤 1.操作流程图 酶底物法即可以作定性又可以作定量分析,同时检测两个指标,总大肠菌 群(total coli)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli),方法简便,快速, 结果准确。 2.操作说明 注意:如果不按照说明使用机器,可能会有人员伤害、机器损害、其他财 产损害以及出现检测结果不准确。 (1) 操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。 (2) 打开电源开关,橙黄
4、色指示灯应当亮起。 (3) 程控定量封口机需要预热直到绿色指示灯亮起(大约 10 分钟) 。只 有当两个灯都亮时,才说明机器达到工作温度。 3 (4) 大肠菌群、大肠埃希氏菌:取 100mL 水样加入酶底物试剂 1 支混匀, 转入 51 孔或 97 孔定量盘内(注意:在取水样和去定量盘时手不能触碰到含有 少量硫代硫酸钠的无菌取样瓶及定量盘封口处,以免影响检测结果),封口后 于 361培养 24h,观察结果。耐热大肠菌群:实验同上,但培养温度变为 44.50.5 (5) 把橡胶垫放到进口托盘架上,有大矩形孔的一头在外。 (6) 把装有样品和 DST Colilert 试剂的定量托盘放入橡胶垫中,
5、注意 定量托盘的每个凹陷要对准橡胶垫上对应的空。 (7) 向机器方向轻轻推动橡胶垫,直到机器抓住橡胶垫,并带动其进入 机器。 (8) 大约 15 秒钟,定量托盘封口完成,从机器后出来。请从机器后拿 出橡胶垫和定量托盘。 (9) 任何时候,如果需要使机器反转,从前面退出橡胶垫(例如当定量 托盘没放平就将橡胶垫放入机器) ,请按反转钮。但是,当橡胶垫已经完全进入 机器中,请不要按反转开关。如果有多个橡胶垫,可以连续放入机器。 检测结果说明: 现象 结果 比阳性比色对照品的黄色浅 总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴性 与阳性比色对照品的黄色相近 或更深 总大肠菌群为阳性 与阳性比色对照品的黄色相近 或更深
6、,且在紫外灯下显荧光 总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阳 性 (10) 在暗室中,使用 6 瓦,366nm 的紫外灯在距样品 15 厘米左右的位置 观测是否显荧光。 (11) 结果应在 24-28 小时内读取。此外,总大肠菌群和大肠埃希氏菌培 养时间小于 24 小时已经为阳性;或总大肠菌群和大肠埃希氏菌大于 28 小时依 然为阴性,则结果也有效。 注意: 1.检测试剂于 230避光储存; 2.a.使用过的取样统一收集进行灭菌处理; b.橡胶插垫可以放到高压消毒锅中进行消毒,也可以用异丙醇或家用漂 白剂清洗。清洗时应注意这些清洗剂的危害。要经常清洗橡胶插垫,确保橡胶 插垫上不要有污垢。 一般情况下可使
7、用柔软的干布清洗封口机外壳。也可以用异丙醇或家用漂 4 白剂清洗,但要注意个人防护。 只有专门指定的人员才可以打开封口机的前挡盖。请参照保养手册,清洗 封口机的内部。清洗工作一定要有经过培训的人员来完成。如果有样品从机器 中滴出,请不要打开前挡盖或使得封口机倾斜; 3.拿出定量盘后应尽快用无菌夹子夹住袋口,以免剩余定量盘被细菌感染; 4.使用后关掉机器; 5.技术参数 重量 规格 (cm) 周围温度 电源 16 公斤 30H x 27D x39W 0-32oC 220V,50Hz,3Amp 附表: 1.51 孔定量盘法不同阳性结果的 MPN 值表 2.97 孔定量盘法不同阳性结果的 MPN 值表