1、第 五 章 微生物的生长和环境条件 1 第 一 节微 生 物 的 个体与群体生 长 微生物生长：是指细胞物质有规律地、不 可逆增加的生物过程。 微生物繁殖：是微生物生长到一定阶段由 于细胞内各种细胞结构的复杂和重建导致 产生新的生命个体，即引起生命个体数量 增加的整个生物学过程。 2 一 . 微 生 物 的 个体生 长 细菌的拟核 DNA的复制与分离 3 二、细菌纯培养生长曲线 是将某种单细胞微生物少量接种到恒定容 积的液体培养基中培养，定时取样分析。 以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐 标作图而的达到的曲线。 4 细菌纯培养生长曲线图 5 1.延迟期 (Lag phase） 特点： （ 1
2、） .细菌数量不增加或增加很少，代谢活跃； （ 2）细胞内 RNA，尤其是 rRNA的含量很高，细胞 的嗜碱性强； （ 3）细胞体积增大，拉长； （ 4）细胞内的代谢活力强，特别是合成一些必需 的酶类； （ 5）抗性有所降低，对不良环境因素表现很敏感 。 6 细胞的最初个数和生长一段时间后个数之 间关系： N = N 0 2 n 式中： N 细胞最终数目 , N 0 细胞初始数目 , n = 指数生长期细胞繁殖代数。 7 细胞生长的代时 G: G t / n t=指数生长期时间 : t = t 2 t 1 8 繁殖代数 n的计算 : N = N 0 2 n lg N = lg N 0 + n
3、log2 lg N lg N 0 = n log2 9 n = (lg N lg N 0)/ lg2 = (lg N lg N 0 )/ 0.301 = (lg N / N 0 )/ 0.301 10 G t / n ( t 2 t 1)/ (lg N / N 0 )/ 0.301 单位时间内细胞分裂次数 (R) : R=n/ ( t 2 t 1) =1/G 11 2.对数期 （ Log phase）特点 （ 1）代时最短，生长速度最快； （ 2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各 种物质按比例生长，菌体成分均匀； （ 3）酶活性高，代谢稳定，菌体大小基 本一致。 12 3.稳定期 （ Stati
4、onary phase） 特点： （ 1）新生 =死亡，达到动态平衡，生长速 度为零 ； （ 2）活菌数的总量达到最大值； （ 3）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒 、脂肪粒等）； （ 4）某些芽孢菌的芽孢开始形成； （ 5）某些细菌过量积累次级代谢产物， 如抗生素、维生素等。 13 4.死亡期 （ Death phase） 特点： （ 1）生长速率负增长； （ 2）细胞形态多样，出现畸形，形成衰 退型； （ 3）蛋白水解酶活跃，出现细胞自溶现 象； （ 4）芽孢细菌芽孢大量释放。 14 第二节 微生物的培养与生长量的测定 一、纯培养技术 纯培养：微生物学中将在实验室条件下从 一个细胞或一种细胞
5、群繁殖得到的后代称 为纯培养 15 获得纯培养的技术 1. 稀释平板分离法 2. 原理同稀释平板计数 16 2. 平皿划线分离法 3. 以沾有微生物的接种环在固体平板 上不断划线以稀释接种环上微生物数量 ，最终可在划线处使微生物以单细胞表 达式分开。经培养后形成单菌落。 17 3. 富集培养 4. 用选择性培养基及培养条件，使被 研究的微生物在培养物中的数量由少数 转化成多数。 5. 用于样品中数量占少数的微生物， 或研究难以分离纯化的微生物。 18 4. 二元培养：是纯培养的一种特殊形式， 主要用于分离寄生微生物的方法。 5. 如噬菌体和细菌的培养物。 19 5. 共培养 (Cocultur
6、e) 6. 用于培养一些在生长代谢过程中紧密相 互依赖的微生物。 7. 如厌氧条件下丁酸的降解： 8. 丁酸 乙酸 +氢 （丁酸降解菌 ） 9. 氢 +CO2 甲烷 （产甲烷菌） 20 例：丁酸盐降解菌群的富集与分离 厌氧条件下： 丁酸 甲烷 +CO2 丁酸 乙酸 +氢 （丁酸降解菌） 乙酸 甲烷 +CO2 （产甲丝烷菌） 氢 +CO2 甲烷 （产甲螺烷菌） 21 富集培养基： 丁酸钠 30mM 硫化钠 0.016 Na2CO3 0.08 半胱氨酸 0.5 酵母膏 1.0 K2HPO4 0.5 MgSO4.6H2O 0.33 NH4Cl 0.4 CaCl2 0.05 刃天青 0.002 微量元
7、素 22 分批培养的特点 微生物培养时间不同其生长状态不同 培养时间较短 容易控制无菌条件 能保证菌种的最小变异 适合于微生物细胞的生长与代谢产物的 积累不同步发酵 23 (二 )连续培养 指控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗 去的营养物质及时得到补充，培养基中营 养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定 生长速率 。 24 恒浊培养 微生物生长量的控制 恒化培养 微生物营养量的控制 25 连续培养的特点 培养过程微生物的生长状态一致 . 设备的利用率高 培养周期长 , 容易污染 菌种易变异 适应于以微生物细胞为目的或产物与生 物量成正比的产物的发酵 26 分批补料培养 27 四、微生物生长量的测
8、定 1.直接计数法（全数法） (1) 计数器计数法： 血球计数板 细菌计数板 28 涂片染色计数法 用一定量的菌液（ 0.1ml)涂布 一定大小的 面积（ 1.0cm2)染色后计数。 29 (3) 比浊法 (4) 用分光光度计或浊度计测定菌液的 吸光度，菌体的数量与其吸光度成正比 。适用于较高浓度的液体样品的测定。 30 2.间接计数法（活菌计数法） (1) 平板菌落计数法 其原理为单个细胞涂布在固体平板上经培养 后可形成肉眼可见的单菌落。依此推算原样 品中的微生物数量。 适用于 30个 /ml菌以上的液体样品。如为固体 样品要求菌数更高。方法的测定周期较长。 31 (2) 液体稀释培养测数
9、适用于不易形成菌落的微生物（如硝化细菌） 数量的测定。 32 (3) 薄膜过滤计数法 (4) 用滤膜对样品进行过滤，使微生物被截留 、浓缩在滤膜上，经培养后测定形成的菌落 数。适用于含菌量少的空气及水中微生物的 测定 。 33 3.测定细胞物质量 (1) 干重法 (2) 含氮量测定法 (3) DNA测定法 (4) 其他生理指标测定法： 对氧的吸收 发酵糖产酸量 二氧化碳的释放量等 34 第 三 节微生物生长与环境条件 一 些 基 本 术 语 灭菌（ sterilization) 是指利用某种杀死物体中包括芽孢在 内的所有微生物的一种措施 . 35 防腐（ antisepsis) 是在某些化学物
10、质或物理因子作 用下，能防止或抑制微生物生长的一 种措施，它能防止食品腐败或防止其 它物质霉变。 消毒（ disinfection) 是利用某种方法杀死或灭活物质 或物质中所有病原微生物的一种措施 , 它可以起到防止感染或传播的作用 . 36 一、温度 （一）温度对微生物生长及生存的影响 1. 微生物生长的温度范围 最低生长温度 : 指微生物能进行繁殖的最低温度界限。 最适生长温度： 指使微生物迅速生长的温度 。 最高生长温度： 指微生物生长繁殖的最高温度界限。 37 各类微生物生长的温度范围 微生 物 类 型 最低温 度 oC 最适温 度 oC 最高温 度 oC 高温 型 30 455 5
11、6075 中温 型 5 253 7 4550 低温 型 0 101 5 2030 38 2. 高温对微生物生存的影响 致死温度： 致死微生物的最低温度界限。 致死时间： 在一定温度下杀死微生物所需要的最短时 间。 39 （二） 利用高温灭菌的方法 1. 干热灭菌 (1) 干热灭菌法： 160 处理 12小时。适用于玻 璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点：可 保持物品的干燥 。 (2) 灼热灭菌法：常用于金属性接种工具、污染 物品及实验材料等废弃物的处理。 40 （ 1） 煮沸消毒法： 100 ， 15分钟以上。只能杀死微生物 的营养细胞。 （ 2） 高压蒸汽灭菌法： 1.05kg/cm2（
12、 15b/in）的蒸汽压， 121 处理 1530分钟。彻底杀死所有的微生 物。 2. 湿 热 灭 菌 41 （ 3） 间歇灭菌法： 常压蒸汽消毒 培养 反复多次的灭菌法，可杀死所有的微生物 细胞。 （ 4） 巴斯德消毒法： 用较低的温度（如 6263 ， 30分 钟）处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中 的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，同时 又不损害营养与风味的方法。 42 二、氢离子浓度（ pH） 1. 微生物生长 的 pH范围 2. （ 1）多数细菌、藻类及原生动物的 适宜 pH范围为 6.5-7.5。 3. （ 2）真菌的适宜 pH范围为 5-6。 4. （ 3）放线菌的适宜 pH范围 7
13、.5-8.0 。 5. （ 4）氧化硫杆菌能 在 pH1.0-2.0的 环 境中生长。 6. （ 5）一些嗜碱菌 能在 pH11.0生长。 7. （ 6）微生物细胞内部 pH一般保持在 中性。 43 氧化硫杆菌能 在 pH1.0-2.0的 环境中生 长。 一些嗜碱菌 能在 pH11.0生长。 微生物细胞内部 pH一般保持在中性。 44 几种微生物的 pH适应范围 微生 物 最低 pH值 最适 pH值 最高 pH值 圆 褐固氮菌 4.5 7.47.6 9.0 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0 亚 硝酸 细 菌 7.0 7.88.6 9.4 氧化硫硫杆菌 1.0 2.02.8 4.06.
14、0 嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.0 6.8 放 线 菌 5.0 7.08.0 10.0 酵母菌 3.0 5.06.0 8.0 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0 45 2. pH影响微生物生长的原因 （ 1）氢离子影响细胞膜中的酶活性 ; （ 2） pH值影响培养基中有机化合物的离 子化 ,从而间接影响微生物 （ 3） pH值影响一些物质（ Fe2+,Mn2+等） 的溶解度 46 3. 微生物代谢对环境的影响 （ 1）微生物发酵糖类产生有机酸：氧化硫 杆菌代谢生成硫酸。 （ 2）微生物对含氮有机物的分解产成碱。 4. pH的控制 （ 1）培养基中加入缓冲微生物质。 （ 2）培养基中加
15、入 “ 备用碱 ” 。（碳酸钙 ） （ 3）培养过程中流加酸或碱。（大规模培 养） 47 三、水 几类微生物生长的最适 aw 微生物 类 群 aw 一般 细 菌 0.91 酵母菌 0.88 霉菌 0.80 嗜 盐细 菌 0.76 嗜 盐 真菌 0.65 嗜高渗酵母 0.60 48 四、氧和和氧化性还原电位 （一）氧 1.氧对微生物的影响主要有三种作用： (1) 可作为生物氧化的最终电子受体。 (2) 对生物体产生毒害作用 (3) 影响环境中和生物体中的氧化还原电位 。 49 2. 根据氧对微生物的不同作用可将微生物 分为以下五类： (1) 严格好氧 氧气是好氧性微生物呼吸的最终电子受体 ，是不
16、可缺少的生活 条件。 (2) 微好氧 只需要少量氧气 (210 氧气 )。 50 (3) 厌氧 必需在缺氧的环境中生活，氧气对严格厌 氧性微生物有毒害作用。 (4) 兼性厌氧 适应范围广，在有氧无氧的环境中均能生 长。 (5) 耐氧 不需要氧气，但氧气的存在对它们没有毒 害作用。 51 3. 氧对厌氧微生物产生毒害作用的机理 （ 1）氧在还原过程中的各种中间产物 O2 + e - O 2- （ 超氧化物） O2-+ e - + 2H + H 2O2 （过氧化氢） H2O2 -+ e - + H + H 2O + OH OH + e - + H + 2 H 2O 52 （ 2） 微生物的解毒作用
17、 产生超氧化物岐化酶 ： 2O2- + 2H + 超氧化物岐化酶 H2O2 + O2 产生过氧化氢酶： 2H2O2 过氧化氢酶 H2O+ O2 总反应： 4O2- + 2H + 2 H2O + 3O2 53 （二）氧化还原电位势 (Eh) 1. 不同种类的微生物生长的 Eh范围 好氧微生物： +0.1 V；最适 +0.3+0.4V ； 厌氧微生物： -0.1V; 产甲烷细菌： -330 mV； 54 2. 影响氧化还原电位的因子 (1) 分子态氧的影响， (2) 培养基中氧化原物质的影响。 (3) 微生物本身的代谢作用 55 辐射的杀菌和诱变作用 辐射能一般对微生物细胞有杀伤作用，可 用于进行
18、微生物的灭菌处理。 辐射也能造成细胞 DNA的损伤，引起微生 物突变。故也可用于菌种的诱变育种。 56 1. 紫外线（ 130-360nm) 特点： (1) 波长为 250280 nm波长的紫外线杀菌 力最强。 (2) 主要作用于 DNA， 能形成胸腺嘧啶二 聚体。 (3) 有光复活作用。 (4) 穿透能力差，适合于空气和物体表面 的灭菌。 57 2. 电离辐射 (1) 种类： X-射线与 - 射线、 - 射线和 - 射线 (2) 杀菌原理： 射线引起环境中和细胞中水分子分解，并 产生自由基。生成的自由基能与细胞中的 敏感大分子反应并使之失活。 58 六、超声波 超声波可通过其高频率震动与细胞
19、振动的 不和谐而造成细胞周围环境的局部真空， 导致细胞周围压力的极大变化，这种压力 变化促使细胞破裂，引起机体死亡。 微生物细胞破碎常用方法 59 七、化学药物 1.氧化剂： KMnO4、 H2O2、 Cl2等 2.还原剂：甲醛等 3.表面活性剂： 乙醇、酚、来苏儿等 4.重金属盐类： 0.1% HgCl2、 AgNO3等 5.其它化学药物： 1%KOH、 1%H2SO4、 结晶紫等 6.化学疗剂 (1) 抗生素 (2) 抗谢物 60 二 . 微生物的抗逆性 （一）抗药性 获得抗药性质粒 产生降解酶，使药物失去活性 通过基因突变 修饰和改变药物作用靶位 改变细胞对药剂的渗透性 形成救护途径 61 62 （二）微生物对高温的抗性 （三）微生物对极端 pH 值的抗性 （四）微生物对重金属离子毒害的抗性 改变细胞膜透性，阻止其进入细胞 产生螯合剂，抵抗金属离子的毒害 酶促反应，转变有毒物质为无毒化合物 63 第 五 章 微生物的生长和环境条件 结 束 64
