1、生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 一、 实验目的 1. 了解米氏常数的测定方法 2. 学习提取生物组织中的酶 二、 实验原理 1. 米氏反应动力学 米氏方程 (Michaelis-Menten Equation): 2. 米氏常数的意义： 反映酶的种类：Km 是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、 底物浓度无关。 米氏常数是酶促反应达到最大反应速度 Vmax 一半时的底物浓度。其数值大 小反映了酶与底物之间的亲和力：Km 值越大，亲和力越弱，反之 Km 值越 小，亲和能力越强。 Km
2、 可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km 值最小的酶促反应对应底 物就是该酶的最适底物。 3.米氏常数的求法： 生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 该作图法应用最广。但在低浓度是 v 值误差较大，在S 等差值实验时作图点较 集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将 1/S配成等差数列，这样可使点 距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。 此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是 1/v 会放大误差，同时对底物浓度的选 择有要求。SKm 时直线将在原点附近与轴相 交。 4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基
3、： POD：过氧化物酶 该方法的缺点是难以确定最大反 应速度 Vmax。 生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 SOD:超氧化物歧化酶 CAT：；过氧化氢酶 5.过氧化氢酶的作用： 植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生 成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧 化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强， 可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT） 可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正 常生活，因此
4、 CAT 是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的 抗逆性密切相关。 6.过氧化氢酶活力的测定方法： 紫外吸收法： 过氧化氢在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶 液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出 过氧化氢酶的活性。 （以一分钟内 A240nm 下降 0.1 为一个单位） 滴定法（高锰酸钾法、碘量法） 在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标 准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗 的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。 7.实验中的反应 ： H2O
5、2 被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性 环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度: 酶 2H2O2 2H2O + O2 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2 （本实验以马铃薯提供过氧化氢酶） 三、 实验试剂 1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液 (pH=7.0): 实验室提供 . 2. 酶液: 称取马铃薯 5g, 加缓冲液 10mL, 匀浆过滤. 3. 0.01mol/L 高锰酸钾. 4. 0.098mol/L H2O2. 5. 25%H2SO4. 四、 实验操作 取 6 只锥形瓶, 按下
6、表的顺序加入试剂. 生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达 5min 立即加入 2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用 0.01mol/L 的 KMnO4 溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。 五、注意事项： 1.反应时间必须准确。 2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。 3.滴定终点的判定。 六、实验结果： 过氧化氢浓度：0.098mol/L 称取马铃薯的质量：5.00g 高锰酸钾：0.01mol/L 序号 1 3 4 5
7、V（KMnO4） /ml 2.7 4.4 6.32 12.4 生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐 121140012 2013/11/28 S/(mol/L) 0.0098 0.016368 0.0245 0.049 v/(mmol/min) 0.0061 0.010732 0.0174 0.036 1/S 102.0408 61.0948 40.8163 20.4082 1/v 163.9344 93.1793 57.4713 27.7778 米氏常数 Km= -0.1913 七、实验结果分析： 1.曲线上少一个点的原因： 用移液管移取序号为 2 的过氧化氢溶液（应为 1.25ml）错
8、误的移取了 1.75ml， 故在制图时将其舍去。 2.曲线线性较好（R=0.9988）的原因： 本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成， 所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。 3. Km 计算结果呈负值的原因： Km 呈负值（即整条直线都向下移动） ，亦即所有测定的 v 值都偏大。 由 v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推断最可能的原因是 V2 整体测量偏小，可能的 操作失误是编号为 0 的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点 的整体的高锰酸钾量都偏小。 米 氏 常 数 计 算 曲 线 y = 1.6828x - 8.7953 R2 = 0.9988 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 1/S 1/v 系 列 1线 性 (系 列 1)
