1、项目五 对流免疫电泳试验 (Counter immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作用下 能相对移动，所以二者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度比例合适之处形成白色沉 淀线。据此临床常用该方法检测抗原，以诊断某些疾病。 【试剂和器材】 1AFP 阳性血清、待检血清、抗 AFP 诊断血清。 2pH8.6 0.05 mol/L 巴比妥缓冲液。 巴比妥钠 10.3 g 巴比妥 1.84 g 先将巴比妥置于三角烧瓶中，加入 200ml 蒸馏水，加热溶解后再加入巴比妥钠， 最 后加蒸馏水至 1000ml
2、。 3琼脂凝胶 按需要量称取琼脂粉，加入 pH8.6 0.05mol/L 巴比妥缓冲液，使琼脂浓 度为 12g/L，沸水浴中溶解至澄清。 4电泳仪、电泳槽、万用电表。 5载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。 【步骤和方法】 1制备琼脂凝胶板 取溶化的琼脂 34ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。 2打孔 用绘图笔尖按图 1-6 打孔，孔径约 3mm，孔距 45mm，挑去孔中凝胶。 3加样 用滴管按图 1-6 分别加入抗血清、AFP 阳性血清、待检血清，以加满孔为宜， 注意不要溢出。 4电泳 将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极 端，两端分别以 23 层滤纸或纱布搭桥，使凝
3、胶和槽中缓冲液相接。按通电源，将电压控 制在 46V/cm 长，或电流 34mA/cm 宽，电泳 3060min。 【结果判定】 电泳完毕后关闭电源，待 1530min 后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染色后保 存。 阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。待检血清孔与抗血清 孔之间出现白色沉淀线为阳性，不出现者为阴性。 A g A g A bA b + _ 1 2 3 4 1 阳性对照孔 24 待检血清孔 图 1-6 对流免疫电泳 【注意事项】 1当标本为脂血症、陈旧血标本或由于 2-巨球蛋白可引起假阳性，它靠近阳极呈弧 状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别，即阳性对照孔与
4、待检孔间距为 0.2cm，在两孔 中间相距 0.4cm 处打抗血清孔，加样后电泳，两沉淀线吻合为阳性，相交为阴性，其它试 验条件与以上试验相同。 2电泳缓冲液的 pH 值、离子强度、电压和电泳时间对检测结果均有影响，应注意控 制。 3电泳时间随孔间距的增大需适当延长。当两孔距离为 1cm 时，电泳时间为 1.52h；孔间距为 0.6cm 时，电泳时间为 1h。 4抗原与抗体浓度比例应适当，可通过稀释抗原适当调整，以免出现假阴性。 【方法评价】 1简便、快速，敏感度比双相免疫扩散法高 816 倍。 2必须使用高特异性、高亲合力的诊断抗体，否则结果难以解释。 3必须选用有高电渗作用的琼脂作支撑介质
5、。 【临床意义】 对流免疫电泳在临床常用于定性检测某些抗原，以对某些疾病或传染病作快速诊断。 也可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线位置、形状作抗原和抗体相对浓度的分析。由 于该方法分辨率差，当有多种抗原抗体反应系统存在时，形成的沉淀线常重叠，而难以分 辨，所以不用该方法作某种抗原或抗体组分的免疫化学分析。 【思考题】 1对流免疫电泳试验原理如何?为何选用高电渗作用琼脂作为凝胶介质？ 2为何对流免疫电泳比双相免疫扩散试验敏感性高？ 项目六 火箭免疫电泳试验 (Rocket immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 抗原在含一定浓度抗体的琼脂板一端，在电场作用下，向另
6、一端泳动时抗原抗体复合 物形成的沉淀呈圆锥形，状似火箭而得名。它实质上是在电场作用下的凝胶内单相免疫沉 淀试验。当抗体含量不变时，沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。因此用已知不同浓度标准 抗原制成标准曲线，即可求出标本中抗原含量，所以又称单相定量免疫电泳。 【试剂和器材】 1pH8.6 0.05mol/L 巴比妥缓冲液。 230g/L 缓冲琼脂 称取 3.0g 琼脂粉置 250ml 三角烧瓶中，加蒸馏水 50ml，沸水浴 中溶解，然后加入上述巴比妥缓冲液 50ml 混匀后，置 4 冰箱保存备用。 3AFP 诊断血清。 4待检样品(脐带血清或肝癌病人 AFP 阳性血清)。 5参考血清(已知 AFP
7、标准抗原)。 6电泳仪、电泳槽、3765水浴箱、万用电表。 7载玻片、打孔器、微量加样器等。 【步骤和方法】 1取 30g/L 缓冲琼脂，置水浴煮沸溶化，放 52水浴平衡。 2释释血清 根据抗体的效价，用 0.025mol/L 巴比妥缓冲液将抗体作适当稀释 (一般 作 1:201:50 稀释)，置 52水浴保温。 3浇板 将稀释抗血清与 30g/L 缓冲琼脂等量混合，注意保温，防止产生气泡(在水 浴中操作，动作要轻缓)，用吸管吸取混匀琼脂迅速滴加于载玻片上，每片琼脂量 3.5ml。 载玻片要放在水平台上，使浇注的琼脂板厚度均匀。 4打孔 取冷凝后的琼脂板，在距一端 1.5cm 处用打孔器等距离
8、打 3 个孔，挑去孔内 琼脂( 图 1-7)。操作中防止孔四周出现裂纹或破损，否则将影响沉淀峰形状，结果不准确。 图 1-7 火箭免疫电泳图 5加样 用微量注射器分别于孔内准确地加入待检样品以及不同浓度的标准抗原各 10l。 6电泳 电泳槽内盛 0.05mol/L 巴比妥缓冲液。将加好样品的琼脂板置于其上，抗原 孔侧放阴极端，用缓冲液浸湿的双层滤纸两端搭桥进行电泳。开始电压为 25V/cm，维持 1520min，然后增加到 2530V/cm(需冷却装置)，电泳 13h 至完全成峰；或 510V/cm 过 夜。 7电泳结束后取下琼脂板，如沉淀峰清晰即可直接判读测量结果，否则可将琼脂板浸 泡于 1
9、0g/L 鞣酸生理盐水中会使沉淀峰更明显。如欲永久保留标本，可将琼脂板进行干燥、 染色处理(见双相免疫扩散试验 )。 【结果判定】 1沉淀峰呈尖角火箭形则表示无游离抗原，泳动已到终点；如呈钝圆形或没有峰顶， 前端云雾状则表示还未到终点。 2从抗原孔中心至火箭顶为沉淀峰高度。以已知标准抗原含量作横坐标，沉淀峰的高 度作纵坐标，绘制成标准曲线。根据待检样品沉淀峰的高度查标准曲线即可计算出待检样 品中 AFP 的含量。 【注意事项】 1应选用低电渗作用的琼脂糖作凝胶介质，可避免电渗作用所引起的某些标本的火箭 峰倒退。 2抗原过浓会使沉淀峰无峰顶，看不到终点；抗体过浓则沉淀峰太低，降低试验敏 感度，甚
10、至沉淀峰无法测量；抗体和抗原浓度应适宜。 3为防样品向四周扩散，加入样品后应尽快电泳，或在电压为 23V/cm 通过凝胶介 质的情况下加入样品，使结果判定更为准确。标本与标准抗原必须在相同的电泳条件下进 行电泳。 4高压电泳所需时间短，但需冷却装置。低压电泳方便，峰形清晰，但需时较长。 5其它注意事项请参考单相免疫扩散试验。 【方法评价】 火箭免疫电泳是在单相免疫扩散基础上发展起来的技术，操作简单，能定量，重复性 较好。灵敏度同单相扩散，可测得g/ml 以上的抗原含量，需时短是其优点。 为提高灵敏度，可用少量 125I 标记的标准抗原和被检抗原共同电泳，在含抗体的琼脂 中形成不可见的火箭峰，经洗涤干燥后，用 X 线胶片显影，可出现同位素显影的火箭峰， 这就是目前采用较多的放射自显影技术。根据放射自显影示踪的峰高即可计算出待检抗原 的含量，可测出 ng/ml 抗原浓度，提高敏感度 2050 倍，扩大了应用范围。可用于多种抗 原的定量测定，如 AFP、HBsAg 等。 【临床意义】 常用于血浆蛋白质、AFP、HBsAg 及尿和脑脊液中 Ig 和补体成分的定量测定。 _ + 【思考题】 1火箭免疫电泳试验原理与单相免疫扩散试验有何不同？ 2为使结果准确，加样时应特别注意什么问题？
