1、分子技术在肿瘤靶向药物 治疗的应用 中南大学病理学系 湘雅医院病理科 周建华 肿瘤靶向治疗 （ Target therapy of cancer ） n 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因， 设计和研发针对这些特定的分子和靶点 药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法 ； n 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶 基因变异类存在与否和变异类型； n 个体化治疗的雏形。 荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization， FISH ） 技术 简介 n FISH = Fluorescence In Situ Hybridization n 利用荧光标记的 DNA探针检测组
2、织或细胞 内与其互补的 DNA片段 n 应用：遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤 n 样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、 骨髓、体液及各种肿瘤组织等 用已知的标记单链核酸为探 针，按照碱基互补的原则， 与待检材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形成可被 检测的杂交双链核酸。由于 DNA分子在染色体上是沿着 染色体纵轴呈线性排列，因 而可以探针直接与染色体进 行杂交从而将特定的基因在 染色体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本 DNA变性 杂交 工作原理 FISH检测染色体易位（ Translocation） 在 淋巴瘤分型中的应用 FISH技术在淋巴造血系统 肿瘤中的应用 检测技术特点 n 不同
3、类型的淋巴瘤染色体易位类型不同 n 优点 l 适用于形态学上难以诊断且 IHC结果不理想的标本 ； l 适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织 。 n 必须结合组织形态学和免疫组化结果作最 后诊断！ FISH基因检测在淋巴瘤的应用 淋巴瘤 FISH检测基因 临床应用 套细胞淋巴瘤 IGH/CCND1融合基因 辅助诊断 滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH融合基因 辅助诊断、判断预后 弥漫性大 B细胞淋 巴瘤 BCL6基因断裂 重组 辅助诊断、判断预后 伯基特淋巴瘤 C-MYC基因断裂重组 辅助诊断 粘膜相关淋巴组织 淋巴瘤 MALTI基因断裂 辅助诊断 胃 粘膜相关淋巴组 织淋巴瘤 API2-
4、MALTI融合基因 指导治疗 弥漫大 B细胞淋巴瘤（ DLBCL） 按免疫组化亚型分为 CD5阳性 DLBCL 生发中心 B细胞样变型 (GCB)、 非生发中心 B细胞样变型 (non-GCB) 3类 可根据 CD10、 BCL6、 MUM1的表达区分生发中 心 B细胞样变型 、 非生发中心 B细胞样变型。 30% 瘤细胞表达 CD10或 CD10(-)、 BCL-6(+)、 MUM-1(-)诊断为 GCB; 其他病例则为 non-GCB。 BCL6 基因断裂 -辅助诊断弥漫性大 B细胞淋巴瘤 BCL6 基因断裂重排 -判断预后 目前研究确定至少 40%的 DLBCL涉及 BCL6基因重排。
5、一项针对 102名 DLBCL患者的 BCL6重排情况及其与预后关系的研 究显示， BCL6阳性患者诊断治疗 36个月后，疾病停止发展的比 率为 82%，携带有 BCL6重排的病例 预后较好 。 BCL6 基因断裂与弥漫性大 B细胞淋巴瘤 Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80. 结果判读 IGH/CCND1融合基因可见于 95%的套细胞淋 巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤鉴别 的重要指标。 uIGH/CCND1融合基因 -辅助诊断套细胞淋巴瘤。 IGH/CCND1融合基因与套细胞淋巴瘤 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。 l 异常
6、细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。 API2/MALT1基因检测试剂盒 探针： GLP API2/GLP MALT1 凋亡抑制因子 2基因（ apoptosis inhibitor-2,API2） ,位于 11号染色体 ; 粘膜相关淋巴组织基因（ Mucosa-associated lymphoid tissue 1 ,MALT1 ） ，位于 18号染色体。 API2基因与 MALT1基因的融合导致凋亡抑制的增加 ，引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。 u API2/MALT1融合基因的检测可以指导抗 HP 治疗 胃 MALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（ HP）感染导 致的慢性胃炎有
7、关， MALT1/API2融合基因阴性的 患者抗 HP治疗有效，阳性患者抗 HP治疗无效。 API2/MALT1融合基因检测意义 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。 l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。 BCL2/IGH重排发生在约 80%-85%的 FL患者中，检测 BCL2/IGH基因重排可以辅助诊断 FL。 BCL2/IGH阴性的 FL患者 3年生存率为 100%，而阳性 者只有 54%； 阴性者 3年疾病无进展为 87.5%，而 阳性者只有 13%。 BCL2/IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤 n BCL2/IGH融合基因 -辅助诊断滤泡性淋巴瘤 n BCL2
8、/IGH融合基因 -判断预后 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。 l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。 结果判读 -阳性结果 结果判读 -阳性结果 约 80%的伯基特淋巴瘤病例发生 t(8； 14) （ q24;q32 ） ； 约 15%的伯基特淋巴瘤病例发生 t(2； 8)(p11;q24)； 约 5%发生 t(8； 22)（ q24;q11） 。 染色体 易位导致 C-MYC基因断裂重组 可能是伯基特淋 巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅 助诊断。 C-MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤 u 辅助诊断伯基特淋巴瘤 结果判读 -阳性结果 FISH技术在乳
9、腺癌靶向治疗应用 乳腺癌 Her-2基因 l 致癌基因： Her-2基因； l 位点： 17q11.2-q12； l 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； l 25-30%乳腺癌病人都有 HER-2的扩 增； l HER-2基因扩增是决定 Herceptin 治疗是否有效的关键性指标。 lHER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生 长能力。 乳腺癌 Her-2基因及蛋白检测 Cerb-B-2 :3+ 完全强膜阳性细胞 30% 2+,1 +,- FISH检测是否有基因扩增 Her2基因 检测流程 石蜡组织标本 IHC检测 再用 FISH 方法检测 1+ 3+2+ + Herceptin治
10、疗 再用 方法检测 Herceptin治疗 FISH检测 + 再用 FISH 方法检测 + A. 无须计数的大簇团信 号（高度扩增） B. 颗粒状信号（ R10， 高度扩增 ）C. 须计数的颗粒状信 号（ R=3.5， 低度扩增 ） A C B Her-2基因扩增状况 30%的肿瘤细 胞全部的细胞膜 高强度着色 免疫组化 （ 3+） 与 FISH对比 40 100 浸润性导管癌 级 IHC： + FISH： 呈 簇团状高度扩增 免疫组化 （） 与 FISH扩增阳性 浸润性导管癌 级 IHC： FISH： 呈簇状扩增 肿瘤细胞不着色 40 100 基因突变检测方法 1.RNA酶 A切割 (Rna
11、seAcleavage) 2.变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 3. 杂合双链分析法 (HA) 4. 化学切割错配 (CCM) 5.碳化二亚胺检测 (Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割错配 (Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.单链构象多态性 (Single-Strand Conformation) 8.切割片段长度多态性 9.DNA测序 (Sequencing) 10.双脱氧指纹图谱法 (Dideoxy Finger-printing, ddF) 11.错配接合蛋白检测 12.蛋白截短测试（ protein truncation test） 方法 1
12、3.变性的高效液相色谱检测 (Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC) 14.DNA芯片技术 (DNAchip) 15.等位基因特异性扩增 16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析 (Allele- Specific Oligonucleotide,ASO) 17.引物延伸检测 (Primer Extension,PEX) 18.寡核苷酸连接检测 (Oligonucleotide Ligation Assay,OLA) 19.限制性片段分析 (Restriction Fragment Analysis） 20.突变体富集 PC
13、R法（ mutant-enriched PCR） 21.蝎形探针扩增阻滞突变系统（ Scorpions amplification refractory mutation system） 肺癌组织 EGFR基因扩增和 突变检测及其临床意义 研究背景 n 研究显示吉非替尼对部分晚期 NSCLC患者的治疗 效果非常 显著 。 n 存在 EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼 的治疗敏感。 n 存在 EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶 点药物更为敏感。 n 检测大肠癌有无 EGFR过度表达，只要 1%的癌 细胞的胞膜强阳性染色即判断为 3+，可作为应 用西妥昔单抗的指征。 n FISH检测
14、EGFR基因扩增 l 标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺） 冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞 l 探针类型： GLP EGFR / CSP7 n 定量 PCR检测 EGFR基因突变分型 l 突变类型： 19 exon （ 2235-2249位点） 15bp缺失突变 19 exon （ 2240-2257位点） 18bp缺失突 变 19 exon （ 2240-2251位点） 12bp缺失突 变 21 exon 2573位点 TG碱基置换突变 21 exon 2582位点 TG碱基置换突变 EGFR基因变异检测 双体性 三体性 多体性 扩 增 EGFR 基 因 FISH 检 测 状 况 肺 癌
15、石 蜡 FQ-PCR分型技术检测 EGFR突变 存在 EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71例肺癌组织中检测出 6例突变样本 FQ-PCR 检测 15bp缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为红色阈值线以上的扩增曲线即为 阳性标本的扩增曲线，按荧光信阳性标本的扩增曲线，按荧光信 号值的高低依次为号值的高低依次为 9号、号、 12号、号、 13号、号、 55号、号、 38号和号和 33号标本号标本 15bp缺失突变型 DNA的测序图 sense antisense 红色阈值线以上的扩增曲线即红色阈值线以上的扩增曲线即 为阳性标本的扩增曲线，按荧为阳性标本的扩增曲线，按荧 光信号值的
16、高低依次为光信号值的高低依次为 2号、号、 36号、和号、和 40号标本号标本 FQ-PCR 检测 18bp缺失阳性病例结果 目前 K-RAS突变检测常用技术 方法 n 直接测序 n 焦磷酸测序 n 高分辨率熔解曲线 n PCR-RFLP n 芯片 n 杂交 n Real-Time PCR 肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤 提取 DNA 相应的 PCR反应或杂交 相关的分析和检测 K-ras突变检测基本流程图 直接测序 (Direct Sequencing) PCR扩增后产物直接测序 n 双脱氧核苷酸链终止法 (Sanger法 ) DNA 片段是荧光标记的，这些 片段经过平板胶电泳或毛细管电
17、 泳得到分离，荧光分子被激发而 发光，发出的光信号被检测系统 检测 K-ras突变检测结果 疗效预测标志物与预后判断标志物 n 疗效预测标志物： 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物 n KRAS基因突变导致肿瘤对 EGFR抑制剂抵抗 n 预后判断标志物： 在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标 记物 n 18号染色体长臂（ 18q） 缺失 n 某些分子标志物兼具两种作用 n 胸腺嘧啶合成酶（ Thymidylate synthase） EGFR 作为预后因子的价值 EGFR expression correlates with poor prognosis DFS = Disease-
18、free survival; OS = overall survival Tumor type Prognosis Survival Risk of metastasis References Colorectal Poor Poor - Decreased OS Increased - Hemming (1992) Mayer, De Jong (1992) Head 26:374379MAPK = mitogen-activated protein kinase l K-ras基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。 l K-ras基因突变型患者并不能从抗 EGFR治疗中获益 ,反 而徒增不
19、良反应危险和治疗费用； 抗 EGFR治疗和 K-ras突变相互排斥 K-ras基因抗 EGFR治疗关系密切 n 2009年 7月 FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼 单抗说明书标签的修改： 结直肠癌分子靶向治疗药物 注明 KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这 使用这两种用药物。 l K-ras基因突变 : 20-60%结直肠癌 l K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原 发灶和转移灶的 K-ras基因高度保持一致 K-ras基因突变 NCCN临床实践指南 指南明确指出所有转移性结直肠癌患者 都应检测 K-ras基因状态。 美国 美国临床肿瘤学会 (ASCO)推荐把 K-ras基因突变检测作为
20、 结直肠癌患者接受 EGFR单抗治疗的预测指标。 欧盟药品审评管理局规定： cetuximab 及 panitumumab 用于 mCRC的治疗前，患者必须确定为 K-ras野生型。 K-ras与结直肠癌治疗 结直肠癌（ CRC）缺乏 EGFR基因突变 n 对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌（ mCRC）临床试验中 110例活检标本 进行的研究未发现 EGFR基因突变（ 外显子 18 21） Khambata-Ford S, et al. J Clin Oncol 2007;25:32303237 抗 EGFR治疗前检测 KRAS基因突变 的理由 避免不必要的不良反应 控制不必要的费用 确认能够从
21、治疗中获益的野生型患者 避免治疗对突变型患者的潜在毒性 CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29, 2008 but for patients with wild-type KRAS tumors n 810名胃癌病人有 HER2基因的扩增，约占参与实验总人 数的 22%； n 晚期胃癌接受标准化疗联合 Herceptin治疗的患者： 平 均生存期由 11.1个月延长到 13.8个月； 高倍扩增者甚至可达 16个月； 将死亡风险降低 26%。 HER2与胃癌分子靶向治疗 美国临床肿瘤学会 ASCO提出： u Herceptin可成为 HER2阳性晚期胃癌患者的 治疗选择。 u 晚期胃癌患者在确诊时都应接受 HER2检测； HER基因与胃癌预后 HER2基因扩增的晚期胃癌患者往往预后不佳 。 n 无 HER2基因扩增的晚期胃癌患者中位生存期 12.6个月，而有基因扩增者中位生存期仅 5.5个 月。 n 存在 HER2基因扩增的胃癌患者术后 5年生存率为 21.4%，而无扩增的则为 63.0% 。
