1、 间接 ELISA 检测抗血清效价 姓名：王贤臣 学号：1125400080 （成都医学院 医学检验 成都 610500） 【摘要】目的：通过实验掌握间接酶联免疫吸附测定技术（ELISA）的原理及 操作过程及间接 ELISA 检测抗血清效价的实验条件优化及效价的确定。方法： 间接 ELISA 双抗体夹心法对包被抗原及酶标抗体工作浓度进行探索。结果：经 过预实验初步确定抗人白蛋白血清包被浓度和一二抗的浓度，然后在正式实验 确定其浓度，从而再进行研究。讨论：间接 ELISA 检测抗血清效价的影响因素。 并将预实验方法的结果与确定实验的结果进行对比，和分析在实验过程中的注 意事项。 【关键词】抗人白
2、蛋白 ABL ELISA 前言：1971 年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附测定用于 IgG 定量测 定的文章，使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展为体液标本中微 量物质的测定方法。之一方法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相 载体表面，并保持器免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗 体，这种酶标抗原后抗体即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把 受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载 体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合 物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标
3、本中受检物质的量成一 定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标 本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于 酶的催化频率很高，故可极大的放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏 感度。 实验方法： 预实验设计方案： 1、 材 料 与 方 法 1.1 仪器：洗板机（BIO-RAD MODEL 1575 ） SM 自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所 BIO-RAD 680） 电热恒温箱（上海恒科技仪器有限公司） 移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司） 微孔反应板 刻度吸管 （5ml、1ml） 吸耳球 试管架 塑料试管 封口纸 烧杯 1.
4、2 试剂：人 ALB 标准品（SIGMA :A1653 SIZE:250MG storage:2-8） PBS 缓冲液：0.1M pH7.4(PBS 1L 配方 pH7.4：磷酸二氢钾 (KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯 化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至 1000mL) 包被液：0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液 洗涤液：0.05%Tween-PBS(即 PBST) (0.05%Tween-PBS 1000mlPBS 加 500ul 吐温） 封闭液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液 100mlPBS 加 1g
5、 干酪 素） 显色液（A 液、B 液 Cat:ME002 可溶性 TMB 显色液) 终止液：2M H2SO4 酶标抗体（兔抗羊-HRP，武汉博士德生物工程有限公司） 1.3 待测标本：羊抗人 ALB（效价 1:70 批号：201106 贮存于 4-20，有 效期：2 年） 1.4 方法： 预 实 验 包 被 抗 原 (100ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干 加 封 闭 液 (300ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干 加 入 标 本 (100ul/孔 ) 37 1h 洗 涤 5 次 拍干 加 入 酶 标 抗 体 (100ul/孔 ) 拍干
6、 37 1h 洗 涤 5 次 加 入 显 色 剂 A、 B 液 各 50ul/孔 37 15-20min 加 入 终 止 液 (100ul/孔 ) 检 测 表 1： 包 被 抗 体 和 酶 标 记 抗 体 棋 盘 滴 定 羊抗人 ALB 血清 羊抗人 ALB 血清 兔抗羊 IgG-HRP 1: 10 1: 40 1: 160 1: 640 1: 2560 P B S 兔抗羊 IgG- HRP 1: 10 1 ： 40 1： 160 1： 640 1： 2560 P B S 1:500 1:500 1:2000 1:2000 1:8000 1:8000 1:16000 1:16000 羊抗人 A
7、LB 血清 羊抗人 ALB 血清 兔抗羊 IgG-HRP 1: 10 1: 40 1: 160 1: 640 1: 2560 P B S 兔抗羊 IgG- HRP 1: 10 1 ： 40 1： 160 1： 640 1： 2560 P B S 1:500 1:500 1:2000 1:2000 1:8000 1:8000 1：1600 0 1:16000 （ 1） 将 人 ALB 用 包 被 液 稀 释 为 ： 人 ALB：10 ug/ml 人 ALB：1u g/ml 人 ALB：0.1 ug/ml 人 ALB 0.01ug/ml 0.01ug/ml 0.1ug/ml 1ug/ml 10ug
8、/ml （ 2） 酶 标 结 合 物 （ 兔 抗 羊 IgG-HRP） 稀 释 为 ： 1:500 1:2000 1:8000 1:16000 （ 3） 抗 人 白 蛋 白 血 清 （ 羊 抗 人 ALB 血 清 ） 稀 释 为 ： 1:10 1:40 1:160 1:640 1:2560 在 初 步 结 果 的 基 础 上 继 续 细 化 工 作 浓 度 ， 重 新 检 测 以 确 定 最 终 最 适 包 被 抗 原 和 酶 标 抗 体 的 最 终 工 作 浓 度 ， 即 建 立 间 接 ELISA 法 检 测 抗 人 白 蛋 白 血 效 价 。 正 式 包 被 抗 原 (100ul/孔 )
9、 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干 加 封 闭 液 (300ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干 加 入 标 本 (100ul/孔 ) 37 1h 洗 涤 5 次 拍干 加 入 酶 标 抗 体 (100ul/孔 ) 拍干 37 1h 洗 涤 5 次 加 入 显 色 剂 A、 B 液 各 50ul/孔 37 15-20min 加 入 终 止 液 (100ul/孔 ) 检 测 表 2： 包 被 抗 体 和 酶 标 记 抗 体 棋 盘 滴 定 包 被 抗 原 的 浓 度 为 0.1ug /ml 0.01 ug /ml， 每 个 浓 度 做 三 排 ， 共 做
10、 六 排 ， 测 出 OD 值 羊抗人 ALB 血清 兔抗羊 IgG- HRP 1:10 1:40 1:16 0 1:64 0 1:256 0 1:102 40 1:409 60 PBS 1:8000 1:1000 0 1:1600 0 羊抗人 ALB 血清 兔抗羊 IgG- HRP 1:10 1:40 1:16 0 1:64 0 1:256 0 1:102 40 1:409 60 PBS 1:8000 1:1000 0 人 ALB：0.1ug/ml 人 ALB：0.01ug/ml 1:1600 0 2、 结 果 预 实 验 ： 表 3： 我 们 组 预 实 验 结 果 确定最适抗原浓度 取每
11、个区域中二抗浓度同一行的五个数据进行分析，共得 出 20 张线性关系图，取 R 值最大且稀释比例最大的区域为最适抗原浓度 确定二抗浓度 在确定包被抗原浓度后取该区域中二抗浓度同一行的五个 数据进行分析共得出 4 张线性关系图，取 R 值最大 OD 值最大不超过 2 且稀释 比例最大的区域为最适二抗浓度 人 ALB： 10ug/ml 0 1 2 3 1 2 3 4 5 羊 抗 人 ALB血 清 稀 释 浓 度 吸光 度 系 列 1 系 列 2 系 列 3 系 列 4 人 ALB： 1ug/ml 0 1 2 3 1 2 3 4 5 羊 抗 人 ALB血 清 稀 释 浓 度 吸光 度 系 列 1 系
12、 列 2 系 列 3 系 列 4 人 ALB： 0.1ug/ml 0 1 2 3 1 2 3 4 5 羊 抗 人 ALB血 清 稀 释 浓 度 吸光 度 系 列 1 系 列 2 系 列 3 系 列 4 人 ALB 0.01ug/ml 0 1 2 3 1 2 3 4 5 羊 抗 人 ALB血 清 稀 释 浓 度 吸光 度 系 列 1 系 列 2 系 列 3 系 列 4 注：1、系列 1、2、3、4 分别为兔抗羊 IgG-HRP 1:500、1:2000、1:8000、1:16000 稀释与 不同羊抗人血清稀释浓度（1:10 、1：40、1：160、1：640、1：2560）对应所得的吸光度 图像
13、 2、X 轴 1、2、3、4、5 分别对应羊抗人血清稀释浓度 1:10、1：40、1：160、1：640 、1：2560 由上述四图得：包被抗原浓度在 10 ug/ml 1 ug/ml 0.1 ug/ml 时数据跳动大对 结果意义不大。而包被抗原浓度在 0.1ug/ml 时跳动稍小。因此的包被抗原浓度 在 0.11ug/ml 二抗浓度在 1/80001/16000 最适。 正 式 ： 表 4： 我 们 组 正 式 实 验 结 果 跳 动 很 大 不 成 线 性 关 系 无 分 析 意 义 我 们 以 第 四 组 的 正 式 实 验 结 果 进 行 分 析 注：H、G、F、E、D、C、B、A 分
14、别对应羊抗人 ALB 血清稀释浓度 1:10 、1:40、1:160、1:640、1:2560、1:10240 、1:40960 、PBS 1、2、3、4、5、6 分别对应兔抗羊 IgG-HRP 稀释浓度 1:8000、1:10000、1:16000、1:8000、1:10000 、1:16000 将人 ALB：0.1ug/ml 0.01ug/ml 条件下兔抗羊 IgG-HRP 稀释浓度 1:8000、1:10000、1:16000、1:8000、1:10000 、1:16000 同一行的 7 个数据进行分析， 共得出 6 张线性关系图，取 OD 值最大不超过 2 且吸光度随稀释倍数的增加呈
15、线性变化的曲线所对应的数值作为正式实验结果分析的依据得出效价 人 ALB： 0.1ug/ml 0 1 2 1 2 3 4 5 6 7 羊 抗 人 ALB血 清 稀 释 浓 度 吸光 度 系 列 1系 列 2 系 列 3 人 ALB： 0.01ug/ml 0 0.5 1 1.5 1 2 3 4 5 6 7 羊 抗 人 ALB血 清 稀 释 浓 度 吸光 度 系 列 1系 列 2 系 列 3 注：系列 1、2、3 分别对应兔抗羊 IgG-HRP 稀释浓度 1:8000、1:10000、1:16000 X 轴 1、2、3、4、5、6、7 分别对应羊抗人血清稀释浓度 1:10、1:40、1:160、1
16、:640、1:2560 、1:10240 、1:40960 取 OD 值最大不超过 2 且吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化的曲线所对应的 数值作为正式实验结果分析的依据得出效价 由上两图六张曲线的对比在人 ALB: 0.1ug/ml 兔抗羊 IgG-HRP 稀释浓度 1:8000 条件下吸光 度随稀释倍数的增加呈线性变化最为明显，所以本次实验应以该组实验数据来 计算抗血清效价。 1:10 1:40 1:160 1:640 1:2560 1:10240 1:40960 阴性对照 1.71 1.331 1.046 1.063 0.684 0.702 0.451 0.798 COV=0.1 + OD
17、 阴性对照 COV=0.1+0.798=0.898 阳性：OD 样品COV 阴性：OD 样品COV 所以抗血清效价为 1：640 3、 讨 论 在 本 次 实 验 中 我 们 组 顺 利 测 出 预 实 验 结 果 数 据 ，正式实验未能准确的测量到 位，可能原因有 在实验加样过程中，溶液加样量不均； 当再加入显色液 A、显色液 B 时在孵育过程中对于颜色变化没有掌握好从而 导致颜色过深无法检测其吸光度； 在加二抗孵育结束后再洗完板后由于时间关系必须得等几天才能继续试验， 但在保存过程中没有将板拍干，从而会使结果偏差； 在实验时，拍板未能拍干； 同时在用间接酶联免疫吸附测定技术 ELISA 的
18、双抗体夹心法测定抗血清效价 中影响实验结果的因素有： (1) 实验是由多个人进行操作个人手法不一样很容易引起误差； （2）包被抗原时,因为试剂没有配够，整块板子的抗原前后配制了 3 次，浓度 误差大大增加，对结果造成影响； （3）加入封闭液后放入冰箱内隔了好几天才拿出来进行洗板，拿出来时看到板 子的底部有很多白色的沉淀物，很有可能是滋生了很多杂菌，污染了抗原； （4）第一次预实验的封闭过程进行了三天，极有可能是造成背景过高的首要原 因； （5）加入显色液后看到显色梯度但是没有立即加入终止液导致测量结果没有出 现理想值。而且大家由于操作不熟练加液速度非常慢，也可能影响显色进而影 响结果； （6）
19、在加一抗和二抗时用手指放在反应板上，手上很多杂质比如蛋白质，汗液 污染了板，继而影响了板底得抗原或者一抗二抗等物质。 4、 结论 在 本 次 实 验 中 我 们 组 顺 利 测 出 预 实 验 结 果 数 据 ，正式实验未能准确的测量到 位。根据数据得出包被抗原最适浓度在 0.01ug/ml-0.1ug/ml ，二抗最适比例 在 1：8000 及 1：16000 。在正式实验时数据跳动大没有多大的实际参考价值。 但测得第四组的结果效价为 1：640 参考文献： 1 李宏杰，方磊，程家坤，祖华.ELISA(双抗体夹心法)共系统检测抗-HBe 与 HBeAg 结果分析.J中国现代医生，2007.1
20、0 2吕世静.临床免疫学检验第二版.北京.中国医药科技出版社,2010:92-93 3叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程M.第 3 版.南京：东 南 大学出版社，2006：572-574，618-621. 4李宏杰，祖华，王元桂，等.ELISA 预包被板条室内预检方法的建立及 初 步应用J.现代检验医学杂志，2007，22（3）：9-11. 5李宏杰，许修祥，冉秀珍，等. 基础酶联软件在 ELISA 检测中的跟踪 使用 J.中国实验诊断学，2003，7（2B）：174. 6李宏杰，祖华，王元桂，等.ELISA 板条预检的三种方法比较J. 中华 现 代医学与临床，2005，2（12）：47-49.
