防腐挑战实验.doc

1、第一部分 防腐挑战实验调研结果 1 实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为 300g。 2 微生物挑战性实验 2.1 实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 1） ，国内参照美 国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示） ，所 以更为恰当。 （注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同） 表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 菌株 美国 (药典) 美国 (ISP 公司) 英国 (药典) 德国 (Henkel 公司) 德国 (S&M 公司) 白假丝酵母 黑

2、曲霉 红色青霉 绿色木霉 绳状青霉 大肠埃希氏菌 镉绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 粪肠球菌 产气肠杆菌 表皮葡萄球菌 日勾维肠杆菌 洋葱假单胞菌 肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类 菌株 数量 金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性菌 表皮葡萄球菌 至少选一种 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 变形菌属 发酵革兰氏阴性杆菌 日勾维肠杆菌 至少选两种 铜绿假单胞菌 洋葱假单胞菌 荧光假单胞菌 恶臭假单胞菌 黄杆菌属 非发酵革兰氏阴性杆菌 不动杆菌属 至少选一种 白假丝酵母 酵母 近平滑假丝酵母 至少选一种 黑曲霉 霉菌 黄绿青霉 至少选一

3、种 产芽孢菌 枯草芽孢杆菌 供选用 生产现场分离菌 适当菌株 一种以上 2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基 2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为 3108cfu/ml，此悬液再做 3 倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养 48 小时。将 已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。 用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（310 8cfu/ml） 相同为止； 此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1

4、108cfu/ml 的菌悬液，做细 菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振 荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的 10 倍稀释，每次的稀释用血球 计数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在 190210，落在此范围内的菌悬液为 我们所需的 1108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4 接种 2.4.1 接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容 易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参 考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情

5、况也有差距（因来 自自然界的微生物常常不是单一的种类） 。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了 因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。 2.4.2 接种次数和时间 （1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期 28 天。 （一次加菌 的 28 天微生物挑战实验） （2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验） a 法：第 21 天再接种一次，试验周期为 28 天。 （有实验表明，第 21 天接 菌和不接菌时，第 28 天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同） b 法：每隔两周接种一下，连续三次（即第 1、3、5

6、周接菌，每两周接菌 前分离一次） ，试验周期为 49 天； c 法：每周接种一次，连续 5 次，试验周期为 35 天。 （S&M 公司的资料介 绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品 30 个月内的防腐安全） 2.4.3 操作方法 称取待测样品 30g，对应加入 0.3ml 浓度为 1107110 8cfu/ml 的细菌悬 液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在 32.52.5 的培养箱中培养，霉菌在 22.52.5的培养箱中培养。 a.水溶性样品 10g 加入 90ml 无菌生理盐水，稀释后取 1ml 样品液，加入 9ml 灭菌生理盐 水中，做依次稀释，分别为 1

7、0-1、10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6、10 -7 等稀释度； 取三个合适稀释度的样液，分别吸取 1ml 样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计 数，并做两个平行。 b.油溶性样品 取 10g 样品，加入 10ml 无菌吐温-80 和 10ml 无菌白矿油，再加 70ml 无菌 生理盐水，用无菌玻棒充分混匀； 吸取 1ml 已稀释的样品液，加入 9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别 为 10-1、10 -2、10 -3、10 -4、 10-5、10 -6、10 -7 等稀释度；取三个合适稀释度的样液， 分别吸取 1ml 加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

8、2.5 培养 细菌放在 32.52.5的培养箱中培养； 霉菌在 22.52.5的培养箱中培养； 混合菌在 28的培养箱中培养。 2.6 菌落计数 分别在 0、7、14、21、28 天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完 细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开 平皿，以免燃菌而使下次无法观察。 菌落计数的标准方法： 先选取平均菌落数在 30300 之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围， 选取平均菌落数在 550 之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围； 有两个稀释度在 30300 之间，求比值。若比值2，报告平均数；若比 值2，以其中较小的稀释度计算细菌总数； 所有稀

9、释度都大于 300，以稀释度最高的平均菌落数计算； 所有稀释度都小于 30，以稀释度最低的平均菌落数计算； 所有稀释度均在 30300 之外，其中一个大于 300，而相邻的加一稀释 度小于 30，则以最接近 30 或 300 的平均菌落数计算； 若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算； 若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌 落计数后2，以报告全皿菌落数。 2.7 评价标准 2.7.1 CTFA 推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准 CTFA 的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为 10000cfu/g（ml）和 1000000cfu/g（ml） （CFU

10、为菌落单位） ，要求在第 7 天时霉菌降低 90%，细菌 降低 99.9%，并且在 28 天内菌数持续下降。 2.7.2 美国评价标准 在 CTFA 评价方法的基础上提出的标准，如表 3 所示。 表 3 美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准 评价标准 一次加菌的 28 天微生物挑战实验 防腐效果优良 若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值， 在第七天时下降到 100 cfu/g（ml）以下，第 28 天全部为 0。 防腐效果勉强通过 若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值， 在第七天时下降到 1000 cfu/g（ml）以下。 防腐效果无效 若单菌接种的任何

11、一种微生物，任何一个平行样达不到上述 标准，也达不到 CTFA 的要求。 2.7.3 国内评价标准 国内参照 CTFA 加菌防腐挑战性评价标准。 表 4 国内所用微生物防腐挑战实验评价标准 评价标准 一次加菌的 28 天微生物挑战 实验 重复加菌的微生物挑战实验 防腐效果优良（W） 第 28 天化妆品中存货的细菌 数量1000CFU/ml 第二部分 实验室可采取的方案 1 实验样品 2 微生物挑战性实验 2.1 实验菌株 金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢 杆菌 2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 2.3 试验用菌液的配置 实验前，将各菌株接种于合适

12、的培养基中，于 37（细菌）和 28（霉菌）培养箱中培养。 细菌培养 2 天，霉菌培养 5 天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的 混合细菌（108CFU/ml ）和霉菌悬液（106CFU/ml ） ，置于 4冰箱储藏备用。 2.4 一次加菌的 28 天微生物挑战实验 量取样品 30ml 分别加 0.3ml 混合菌悬液，使得细菌浓度为 106107CFU/ml，霉菌浓度为 104105CFU/ml，充分混匀。将样品在 28 摄氏度下保存，在接菌 0、7、14、21、28d 取 样品分析含菌量（培养计数法） 。 2.6 评价标准 评价标准 一次加菌的 28 天微生物挑战实验 防腐

13、效果优良（W） 第 28 天化妆品中存货的细菌数量10CFU/ml，说明该 样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。 防腐效果尚可（M） 第 28 天化妆品中存货的细菌数量100CFU/ml，说明 该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。 附：实验中所需的仪器和药品 设备名称 需求数量 要求 用途 1 冰箱 1 易清洁消毒 存放菌种、标准悬液 2 电子秤 1 易清洁消毒 样品重量测试 3 浊度仪 1 易清洁消毒 检测细菌菌悬液之浓度 4 无菌操作台 1 易清洁消毒 微生物实验用，要求等级 10000 级 5 生化培养箱 3 易清洁消毒 细菌、霉菌培养各 1 台；保存琼脂为液 体状态及紧急烘干器皿，需

14、用 1 台 6 显微镜 1 易清洁消毒 霉菌总数观测用 7 移液枪 2 1001000 uL 移取菌液用；备用 8 恒温水浴锅 1 易清洁消毒 用于油性样品之充分溶解，规格待定 9 自动灭菌锅 1 自动 物品灭菌用 10 牛角勺 100 称取样品用；备用 11 酒精灯 2 无菌操作台配套用；备用 12 200ml 烧杯 10 盛装样品用；备用 13 500ml 烧杯 10 盛装样品用；备用 14 150ml 三角烧瓶 10 盛装样品用；备用 15 10ml 试管 100 配备塞子 盛装无菌生理盐水；备用 16 移液枪枪尖 100 移液枪配套用；备用 17 培养皿 200（套） 细菌、霉菌总数测定用；备用 18 血细胞计数板 2 霉菌计数用；备用 19 革兰氏染色 配套盒 1 革兰氏染色用 20 普通营养琼脂 10 瓶装 自配培养基用；备用 21 虎红琼脂 10 瓶装 自配培养基用；备用 22 氯化钠 2 分析纯 自配生理盐水用；备用 23 硫酸 1 分析纯 用于配置标准悬液 24 氯化钡 1 分析纯 用于配置标准悬液 25 保鲜膜 2 保存样品用；备用