1、 目目 录录 PCR技术简史技术简史 PCR的原理的原理 PCR的反应体系和方法的反应体系和方法 PCR的的 类型和应用类型和应用 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5 3 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3 5解旋酶 解链酶 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5 3 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3 5 DNA 解旋解链 合成引物
2、子链延长 GGAUCG 5 AUCGCG5 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5 3 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3 5 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5 AUCGCG5 TAGCGCTATCGCATCGACGCT3 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1971年， Khorana提出：经过 DNA变 性，
3、与合适引物杂交，用 DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆 tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以 及 70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以， Khorana的 设想被人们遗忘了 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1985年，美国 PE-Cetus公司的 Mullis等人发明了 聚合酶链反应（ PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA复制 最初采用 E-coli DNA聚合酶进行 PCR， 由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热 DNA聚合酶的应用使得 PCR能高效率的进行， 随后 PE-Cetus
4、公司推出了第一台 PCR自动化热循 环仪 1993年， Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 Kary B. Mullis 1989年美国年美国 Science 杂志列杂志列 PCR 为十余项重大为十余项重大 科学发明之首科学发明之首 ,比喻比喻 1989年为年为 PCR爆炸年爆炸年 ,Mullis荣荣 获获 1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。 生物样品生物样品 DNA片段片段 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗 基因工程产品基因工程产品 法医学检测法医学检测 人类学研究人类学研究 基因组基因组 DNA 获取特定获取特定 DNA片段片段扩增特定扩增特定 DNA 片段片段 DNA聚合
5、酶聚合酶 引物引物 引物引物 M13噬菌体噬菌体 Sanger的的 测序技术测序技术 引物 DNA聚合酶聚合酶 引物 引物 Mullis 的构思的构思 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 特定特定 DNA片段片段 94 变性变性 50-65 退火退火 XX 延伸延伸 94 55 37 Taq DNA聚合酶（聚合酶（ thermus aquaticus) 酶酶 活性活性 (%) 温度温度 ( ) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 7294 55 PCR循环循环 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的 PCR反应体系 4种
6、dNTP混合物 各 200umol/L 引物 各 10 100pmol 模板 DNA 0.1 2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（ min） 温度 （ ） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复 13步 2530轮 目的 DNA片段 扩增 100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA 变性 形成 2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94
7、 时间（ min） 温度 （ ） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复 13步 2530轮 目的 DNA片段 扩增 100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA 变性 形成 2条单链 模板 DNA 95 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 9550 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50 引物 1 引物 2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第 1轮结束 95 第 2轮开始 PCR的基本原理 PC
8、R反应条件 PCR过程 PCR的特点 955072Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第 2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板 DNA 第 1轮扩增 第 2轮扩增 第 3轮扩增 第 4轮扩增 第 5轮扩增 第 6轮扩增 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 灵敏度高 1.皮克 (pg=10-12)量级扩增到微克 (ug=10-6) 水平 2. 能从 100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达 3个 RFU 4.细菌检测的最小检出率为 3个细菌 简便、快速 1.
9、一次性加好反应液， 2 4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提 DNA 引物设计引物设计 ： （ 1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源 序列。序列。 （ 2）引物长度以）引物长度以 15-40 bp为宜。为宜。 （ 3） 碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布 ， G+C占占 50-60%。 （ 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。 （ 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。 （ 6）引物）引物 3 端为关键碱基；端为关键碱基； 5
10、 端端 无严格限制。无严格限制。 3 5 3 5 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列 启动子序列启动子序列 定点突变定点突变 探针标记探针标记 1） PCR反应成分反应成分 （ 1）模板）模板 单、双链单、双链 DNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。结合蛋白类。 一般一般 100ng DNA模板模板 /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件反应条件 （ 2）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓
11、度过高易导致模板与引物错配 ,反应特异性反应特异性 下降。下降。 （ 3） Taq DNA聚合酶（聚合酶（ thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降 ;酶量过少影响反酶量过少影响反 应产量。应产量。 （ 4） dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种 dNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量低则降低反应产量 dNTP可与可与 Mg2+结合，使游离的结合，使游离的 Mg2+浓度下降浓度下降 ，影响，影响 D
12、NA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 （ 5） Mg2+ Mg2+是是 DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。 Mg2+浓度过低会使浓度过低会使 Taq酶活性丧失、酶活性丧失、 PCR产量下降产量下降 ； Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中 dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的 Mg2+浓度。浓度。 2）循环参数）循环参数 (1)变性变性 使双链使双链 DNA解链为单链解链为单链 95oC 20-30秒秒 (2) 退火退火
13、温度由引物长度和温度由引物长度和 GC含量决定。含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合合 ;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。 （ 3）延伸）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定 （ 4）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版 DNA的浓度的浓度 一般为一般为 25-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加 PCR的类型和应用 研究 基因克隆， DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构
14、建， DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他 1）不对称）不对称 PCR 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链 DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限 制性引物和非限制性引物制性引物和非限制性引物 ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是 0.010.5M, 关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组 DNA结构功能的研究结构功能的研究 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物 2)反向反向
15、 PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的 DNA片片 段对某个已知段对某个已知 DNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的的 克隆克隆 ,扩增基因文库的插入扩增基因文库的插入 DNA； 建立基因组步移文建立基因组步移文 库。库。 已知序列已知序列未知序列未知序列 未知序列未知序列 已知序列已知序列未知序列未知序列 未知序列未知序列限制
16、酶限制酶 限制酶限制酶 连接酶连接酶 3）多重）多重 PCR 用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电电 泳泳 引物引物 4） LP-PCR（ Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记 ，用以直观地检测目的基因。，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分 病毒病毒 1 病毒病毒 2 病毒病毒 3 病毒病毒 4 标记引物标记引物 观察观察 PCR产物产物 5）锚式）锚式 PCR 已知靶基因片段两测的序列 VH
17、CH1 CH1 CH2 CH2 CH3 CH3 VH VL VL CL CL cDNA 末端核酸转移酶末端核酸转移酶 3GGGG 5 CCCC 锚定引物锚定引物 3GGGG 5 CCCC 3GGGG CCCC 6） PCR固相分析法固相分析法 模模 板板 生物素生物素 化引化引 物物 PCR 扩增扩增 探探 针针 亲和固亲和固 相相 介质介质 检测探检测探 针信号针信号 7）原位）原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（ In Still PCR， Is PCR） 是由是由 Haase等于等于 1990年首创。它是利用完整的年首创。它是利用完整的 细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的
18、目的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的 片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检 测手段来检测细胞内的扩增产物。测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细 胞中进行扩增。可进行细胞内定位。胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位原位 PCR的作用的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 （ ISH），）， 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于但在每个细胞中
19、目的片段的拷贝数少于 10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准 的的 PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很 高，但却未能与细胞形态学研究相结合。高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊则可把这两者结合起来，成为细胞学诊 断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内 病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内 RNA 表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在表达产物等方面发挥一
20、定作用。在检测细胞的潜在 感染方面也具有重要意义。感染方面也具有重要意义。 操作步骤操作步骤 细胞或组织的固定细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物 人类染色体端粒 DNA的荧光原位杂交照片 8） 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 基因基因 mRNA 蛋白质多肽链蛋白质多肽链 实时实时 PCR技术原理技术原理 PCR技术的应用技术的应用 1) 基因克隆基因克隆 重组重组 DNA 质粒质粒 DNA 基因片段基因片段 5 5 Bam H I Bam H I Bam H I Bam H I GTCCGGAC C
21、CTG CAGG GTCCGGACCCTG CAGG CCTG GGAC GTCC CAGG 质粒质粒 DNA 目的基因目的基因 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 2)基因检测基因检测 A 内源内源 性病变基因性病变基因 正常人A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等 地中海贫血地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡珠蛋白链合成不平衡 A 正常人正常人 病病 人人 正正 常常 病病 人人 ASO探针法探针法 A C T G ASO探针探针 正常正常 病人病人 探针杂交 NC膜 探针 正常人正常人 突变纯合突变纯合
22、 子子 突变杂合子突变杂合子 PCR-RFLP法：法： 限制性内切酶限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因基因 突变突变 限制性内切酶限制性内切酶 正常正常 突变突变 电电 泳泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP 法法 PCR- SSO法法 PCR- SSCP PCR- SSP 3)基因配型基因配型 PCR-SSP 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 引物特异性引物特异性 4）基因）基因 鉴定鉴定 女女 性性 男男 性性 Y引物引物PCR 男性男性 女性女性 法医学分析法医学分析 个体识别、亲缘鉴定个体识别、亲缘鉴定 方法：方法： PCR-RFLP DNA遗传指纹遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性多态性 PCR-SSCP 线粒体线粒体 DNA测序测序 PCR-VNTR多态性检测多态性检测 PCR； 电泳检测电泳检测 父父 父父 子子 母母 现 嫌 1 嫌 2 嫌 3
