1、大肠杆菌 质粒 DNA 的提取（碱裂解法） 此方法适用于小量质粒 DNA 的提取提取的质粒 DNA 可直接用于酶切 PCR 扩 增。 1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中， 4000rpm 离心 1 分钟，弃上清液，使细菌沉 淀尽量干燥； 2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 l 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡； 3. 加入 200 l 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH，1SDS （m/v）)，盖 紧 EP 管口， 快速颠倒离心管 5 次，以混合
2、混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II 接 触，不要涡旋，置于冰浴中； 4. 加入 150 l 预冷溶液 III(每 100 ml 的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L 乙酸钾， 11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O)，盖紧 EP 管口，反复颠倒数次，使溶液 III 在粘 稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 35 分钟； 5. 在最大转速下离心 5min，取上清液于另一新 EP 管； 6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA，振荡混合于室温放置 2 分钟，最大转 速离心 5 分钟； 7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管
3、 壁的液滴除尽； 8. 加 1ml 70乙醇洗涤 沉淀，振荡混合，用 12,000g 离心 2 分钟，弃上清，将开 口的 EP 管置于室温使乙醇挥发，直至 EP 管中内没有可见的液体存在（510 分钟），用适量的 ddH2O 溶解； 9. 用 0.5l 的 RNase 37温育 510 分钟； 10. 电泳鉴定。 乙醇沉淀 DNA 1. 加入 1/10 体积的乙酸钠（3 molL，PH=5.2）于 DNA 溶液中充分混匀，使其最 终浓度为 0.3 molL； 2. 加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20中 1530 分钟； 3. 12,000 g 离心 10 分钟，小心移出
4、上清液，吸去管壁上所有的液滴； 4. 加入 1/2 离心管容量的 70乙醇， 12000g 离心 2 分钟，小心移出上清液，吸 去管壁上所有的液滴； 5. 于室温下将开盖的 EP 管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干； 6. 加适量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。 酶 切 1. 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套 Buffer。 2. 在离心管中加入如下成分： 10Buffer 1l 待切样品 xl 酶 0.5-1l 加水补足 10l 3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。 4. 将离心管置于 37中温育 1-3hr，若 待切样品为 PCR 产物，则可将反应时间
5、 适当延长。 5. 用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。 注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶切 可选用二者活性都较高的 Buffer 或者通用 Buffer，但要注意不能有星反应。 ） 连 接 1. 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。 2. 在离心管中加入如下成分： 10连接 Buffer 1l 待连接的样品（胶回收产物或 PCR 产物，载体与片段的 mol 比为 13-5） 连接酶 0.5-1l 加水补足 10l 3. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。 4. 将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求 而定，一般
6、为 22 1-3hr 或 16连接过夜）。 连接完的样品可直接用于转化，也可放 4冰箱短期保存。 感受态细胞的制备 1. 挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2ml SOB 培养液中，37 摇床过夜。 2. 取 0.5-1ml 过夜培养的菌液转种到 50ml SOB 中，18 剧烈震荡，直到 A600 达 到 0.6。 3. 将培养物转移到 50ml 离心管中，4 4,000rpm/min 离心 10min。同时在冰浴 上配置 TB 溶液。 4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。 5. 取 1ml 刚配的 TB 溶液打散菌体沉淀，再加入 15ml TB（1/3 体积的起始
7、培养 液），冰浴 10-15min，4 4,000rpm/min 离心 10min。 6. 弃上清，沉淀重悬于 4ml TB（1/12.5 体积的起始培养液），冰浴 10min。 7. 加入 280l DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。 8. 将菌液分装于 EP 管中， -80或液氮冻存。 9. 取两管感受态细胞分别加入 1l 无菌 ddH2O（阴性对照）和 1l纯质粒（阳性对 照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。 阴性对照平板上应该无菌落生长， 阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。 SOB 的配制： 蛋白胨 20g 酵母提取物 5g NaC
8、l 0.58g KCl 0.186g 100Mg+溶液 10ml 溶解并加水定容至 1L，12120min 高压蒸汽灭菌 100Mg+溶液： MgCl26H2O MgSO47H2O 溶解并加水定容至 100ml，12120min 高压蒸汽灭菌 TB 溶液的配制： 1M KCl 5ml 0.55M MnCl2 2ml 0.5M CaCl2 0.6ml 0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2ml ddH2O 10.4ml Total 20ml 注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理 0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制： 称取 3.02g Pipes 粉末溶于 80ml dd H2O 中
9、，此时粉末不能完全溶解， 用 10N KOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解， 此时当小心少量地加入 KOH 直至达到所需 PH 值。 转 化 1. 取 100l 感受 态细胞于冰浴上融化。 2. 加入 1l纯质 粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴 30 min。 3. 将菌液放入 42水浴中 热激 90 秒，立即放入冰浴中 2 min。 4. 加入 0.9ml SOC，于 37恒温摇床上 200rpm1hr 温育。 5. 将菌液 4000rpm/min 离心 3min，留 200l 上 清 将菌体打散，均匀涂布于含适当 抗生素的琼脂平板表面，平板
10、于 37倒置培养过夜。 i. 注：新倒的平板可于 37培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。 ii. 当转化的是 TA 克隆连接产物时可在菌液中加入 8l 1M IPTG 和 40l 20mg/ml X-gal 以进行蓝白斑筛选。 重组子的筛选和鉴定 重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定，阳 性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。 1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中，37摇 床培养过夜。 2. 次日取菌液 0.2-0.5ml，13,000rpm3min 离心，弃上清，加入 20l ddH2O 和 20l 酚/
11、氯仿，震荡混匀，13,000rpm5min 离心。 3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒 DNA 作 为阴性对照，根据质粒大小初 步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。 4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒 DNA。 5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析， 酶切体积均为 10l 体系。 酶切样品 进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。 6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。 7. 若用 PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取 0.5-1.0l 菌液为模板进行 PCR 反应，每管反应体系最低可少至 10l，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本
12、进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。 真核细胞的转染 该操作以 Invitrogen 公司的脂质体转染试剂 LipofectAMINE 为例，其它转 染试剂可参照各自的使用说明书进行。 1. 在 6 孔板中接种 1-3105细胞/孔，加入 2ml 完全培养基，置 CO2 孵箱中 37 培养过夜。 2. 待细胞长到 50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液： i. 溶液 A：将 1-2g 待转染的超纯 DNA 稀释到 100l 无血清培养基中 ii. 溶液 B：将 2-25l LipofectAMINE 稀释到 100l 无血清培养基中 3. 混合溶液 A 和 B，轻轻混匀，室温放置 15
13、-45min。 4. 用 2ml 无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入 0.8ml 无血清培养基/孔，将脂质体 复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置 CO2 孵箱中 37孵育 2-24hr。 5. 用完全培养基替换转染液，继续培养。 6. 24-72hr 后 检测蛋白质的表达或传代并加入选择性抗生素以筛选稳定表达株。 转染细胞的稳定筛选 1确定抗生素作用的最佳浓度： 不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确 定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。 1) 提前 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔，接种量以第二天长 成 25%单层为宜，置 CO2 孵箱中 37
14、培养过夜。 2) 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000 g/ml）。 3) 培养 10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为 400-800g/ml,筛选稳 定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半. 2转染按前面的步骤进行。 3转染 72 小时后按 1:10 的比例将转染细胞在 6 孔板中 传代，换为含预试验中确 定的抗生素浓度的选择培养基。在 6 孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细 胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。 1) 滤纸片法：用消毒的 5x5
15、mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上 10-15 秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加压培养。细胞 在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培养瓶中,长满后再转入 75cm2 培养瓶中 培养。 2) 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释（10 -210-10），将每一 稀释度的细胞滴加到 96 孔板中培养，7-10 天后， 选择单 个克隆生长的孔 再一次进行克隆。 4. ELISA 或 Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆 的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保 种。 5. 相关帮助 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医 疗器械、制药设备、医药原料、体外诊 断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询： 需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎：
