1、酸性磷酸酶 Km及 Vmax值测定 清洗试管 24支 酸性磷酸酶： 催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。 一、概述 酶液 磷酸苯二钠 苯酚 磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度 计算出反应速度（用产物生成量 /min来表示） 根据双倒数法计算出 Km及 Vmax 二、实验原理 V= Vmax S SKm + 三、实验步骤： 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 4、 S与 V0关系实验 5、双倒数作图法计算 Vmax和 Km buffe
2、r substrate enzyme Certain Time blank Stop the reaction Color developed 生化实验课老师：于晓虹 实验报告请交到讲台上来 酶液稀释 取上清液微升，稀释 倍，用大试管装 科代表 李博恒 1、 磷酸酶原液的制备： 称取 5g绿豆芽茎（去头去根），加入 pH5.6的 HAC 缓冲液 2ml研磨成浆并静置 30分钟。纱布过滤，取 1.8ml滤液 ,以 6000rpm，离心 20min，取上清。 上清液用 pH 5.6的 HAC缓冲液稀释 30倍，用于实 验。 2、制作酶 反应时间 与产物生成量的关系曲线 （目的：选取合适的反应时间）
3、 加 液 程 序 表 管号 1 2 3 4 5 6 0 磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 精确反应时间 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 0.5 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin酚溶液已稀释好！ 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始 35 保温 10分钟 0 1 2 3 4 5 6 反 应时间 0 3 5 10 15 20 25 吸光度 结果： 以反应时间为横坐标， A680nm为纵坐标，
4、绘制反 应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初 速率的时间范围。 3、制作酚标准曲线 （目的：可从酚标准曲线上查出 A680nm所相 当的酚含量 ,并计算出反应速度（用每分钟 产物生成量来表示） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.4mM phenol standard solution 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 H2O 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1M Na2CO3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Folin-phenol reagent 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0
5、.5 0.5 加 液 程 序 表 35 保温 10分钟 0 1 2 3 4 5 6 7 8 酚含量 /mol 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 0.28 0.32 吸光度 结果： 以酚含量（ mol）为横坐标， A680nm为纵坐标，绘制标准曲线 。 以 0号管作空白，在可见光分光光度计 680 nm波长处读取各管的吸光度（ A680nm）。 4、 S与 V0关系实验 实 验 加 液 程 序 表 管号 1 2 3 4 5 6 0 磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0
6、.20 - - 酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 - 精 确 反 应 15 分 钟 35度 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 35 保温 10分钟 测 680nm处吸光度 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始 实验中需注意事项： 酶反应作用时间精确控制 Tube number 1 2 3 4 5 6 S (mM) 0.5 0.75 1 1.25 1.5 2.5 1/S A680 phenol content（酚含量 ） V0 (mole phenol per min) 1/ V0 实验结果 1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、 V0 反应初速率（ mol/min ）为酚含量除以酶反应时间（ 15分钟）。 3、双倒数作图法计算 Vmax和 Km
