延伸阅读3.doc

1、延伸阅读3 最新的中枢神经系统结核的 PCR 诊断 中枢神经系统(CNS)结核，特别是结核性脑膜炎(TBM)是结核分枝杆菌(M.Tb)感染最为 严重的形式，尽管近期在抗结核治疗方面取得了一定进展，但是在感染的患者中一半以上 会出现死亡或严重的中枢缺陷。CNS 结核的决定性诊断取决于脑脊液（CSF）中 M.Tb 的检 测。现在 CNS 结核的诊断依然是个难题，因为在 TBM 急性阶段广泛应用的细菌学检测方法 的“金标准”（如直接涂片和细菌培养）在检测 CSF 标本中的 M.Tb 时敏感性并不高。与传 统的“金标准”不同, 最近多种分子学方法包括核酸扩增 (NAA)分析技术，特别是聚合酶链 式反应

2、(PCR)分析法，已经作为一个诊断 CNS 结核的新兴方法浮现。因其有快速、敏感和特 异的特点。此外，巢式 PCR 分析技术的革新值得关注，因为他能改进 CNS 结核的诊断。本 文中，对最近的 NAA 方法，主要是 PCR 技术作一概述。 1、 简介 在美国，由 M.Tb 引发的 CNS 疾病特别是结核性脑膜炎(TBM)并不常见，占所有结核病 例的1%左右。中枢神经系统(CNS)结核是结核分枝杆菌(M.Tb)感染最为严重的形式，尽管近 期在抗结核治疗（ATT）方面取得了一定进展，但是在感染的患者中一半以上会出现死亡或 严重的中枢缺陷。此外，由于广泛传播的 AIDS 引起越来越多的免疫功能不全的

3、的群体、逐 渐增加的老龄化人群、免疫抑制剂的广泛应用等原因，使得 TBM 成为一个严重的临床和社 会问题。因为 CNS 结核相对稀少且引起的中枢症状无特异性，所以其诊断有很大难度。对 于 TBM 来说，针对结核进行准确快速诊断和早期治疗尤为重要，否则会导致预后不良和长 期的神经方面的后遗症。然而， M.Tb 传统的基于细菌学的金标准检测法包括直接涂片进行 抗酸染色（AFB）和细菌培养不能对其进行早期诊断，因为敏感性较低且培养时间过长（4- 8周）。 最近，用各种分子学方法，包括 NAA 分析技术，特别是 PCR 分析方法用于检测 CSF 中 M.Tb DNA 已经作为一个诊断 CNS 结核的新

4、兴方法浮现。因其有快速、敏感和特异的特点。 许多学者认为虽然不同的实验室和每种类型的检测方法之间的 PCR 敏感性有着显著差异 (6583%)，但是不能用 PCR 法检测 CSF 中的 M.Tb DNA。而且，有报道将巢式 PCR 法作为 检测 CSF 中 M.Tb DNA 的强效方法。与传统的单级 PCR 相比，这种新方法可显著增强 DNA 扩增的敏感性和特异性。然而，由于其步骤繁琐耗时且有较高的交叉污染的风险，所以用 巢式 PCR 检测 CSF 以诊断 TBM 还有待于改进。目前，常规诊断实验室检测用实时 PCR 法。 除了进行常规的定性分析，实时 PCR 以其高度复制性使精确定量分析成为

5、可能。 本文作者聚焦与 NAA 分析技术特别是 PCR 法的最新进展，并对期刊中和临床上关于 CNS 结核诊断的演进作一概述。 2、 结核的全球流行病学负担 2007年，据世界卫生组织(WHO)统计每年会有9.27百万活性结核新增病例，这导致每年 约1.6百万人死亡。结核依然是一个世界性负担，在不发达国家和发展中国家有大量新增病 例。实际上，在结核发病率上印度、中国、印度尼西亚、尼日利亚和南非依次位列第一到 第五位。在80%的新增病例中，像贫困、过度拥挤、营养不良和免疫系统功能不良等社会和 人口统计学因素在其世界范围内流行起重要作用，而余下的20%结核患者与撒哈拉以南非洲 中的 HIV 有关。

6、在2007年新增的9.27百万病例中，约有1.37百万(14.8%)HIV 阳性。 CNS 感染是结核最为严重的感染形式之一。在美国针对肺外结核进行的大范围流行病学 研究中 CNS 相关的病例占总肺外结核的5-10%，与2010年 CDC 新进估计的5.5%（CVS 结核占 总结核病例的1.2%）相近。在 CNS 结核最大的前瞻性流行病学研究中，从加拿大收集的 1970-2001年间82764个结核病例中，CNS 结核的发病率接近1.0%。然而，尽管在像美国这 样的发达国家中结核病例的总数量在减少，但是，有报道表明肺外结核所占比例在渐进式 增加。造成这一现象的原因在于近年来免疫功能不全患者的增

7、加和 HIV/AIDS 流行率的盛行。 此外，尽管结核的基于人口的总死亡率较低且正在减少，但是已有研究显示伴有肺外结核 （包括 CNS 结核、TBM 和传播性疾病）患者的死亡率会显著增加 现已确认几个引发 CNS 结核的风险因素。年龄（儿童成人）和合并 HIV 感染的患者均 属患 CNS 的高风险因素。其他危险因素包括营养不良、近期小儿麻疹、酗酒、肿瘤成人免 疫抑制剂的应用和社区流行的疾病。发达国家中有研究表明在 CNS 患者中，外国出生的个 体（即出生于发达国家以外国家的人）呈现出更高的患病率。 3、 CNS 结核的现行诊断方法 现在，CNS 结核诊断依然是一复杂问题，因为像直接涂片抗酸染色

8、和 M.Tb 培养等广为应用 的传统的细菌学检测方法不能快速检测出 CSF 标本中的 M.Tb，因其在 TBM 急性阶段敏感性 较差。考虑到 CNS 结核的预后和长期神经后遗症，其急性阶段的快速准确诊断和早起开始 ATT 治疗显得尤为重要。基于微生物技术进行的传统的“金标准”在诊断 TBM 时敏感性较 差且不能及时得到结果，而临床要求诊断方法要更为敏感、快速、精确。现已有应用于结 核病呼吸道标本的检测技术，从这些技术中抽出几个基于分子的方法对 CNS 结核进行诊断， 这种做法是否合适仍处于评估阶段。这些技术包括商品化的 NAA 法和其他 PCR 类方法。此 外，像磁共振成像（MRI）等神经放射

9、成像技术的应用显著提升 TBM 和结核诊断的准确性。 最近，有大量应用神经放射成像技术评估 CNS 结核的报道。公认的 TBM 神经放射方法用于 基础脑膜强化、脑积水和幕上脑实质和脑干梗塞的诊断。而且，通常认为脑内结核瘤强度 有高有低。伴有不规则壁的圆形或分叶状肿物，并且调节对比度后呈均质或环状增强。然 而，当只用神经放射成像技术时，无法区分结核瘤和其他想像真菌颗粒这样的脑内集聚性 损伤。因此，我们认为是基于分子学的技术和神经放射成像结合的方法是有发展前景的方 法，在诊断 TBM 和结核性肿瘤中非常好，而不是伴或不伴有经典的细菌生物学技术的神经 放射成像技术。 肺结核的研究和治疗 4、 PCR

10、 技术的最新进展 诊断 M.Tb 的 NAA 法是通过对来自痰液或 CSF 等临床标本进行 M.Tb 的 DNA 或 RNA 提取 和扩增，以检测是否含有结合杆菌。PCR 技术是典型的 DNA 扩增方法。鉴于 PCR 分析技术 的最新成就和进展，在这部分，我们对其原理做一概括。 4.1PCR 的基本原理 图1简要阐释了 PCR 的基本原理。从根本上说，PCR 分析技术依赖与热循环，包括重复 加热和冷却以使 DNA 变性及其酶的复制。短的 DNA 片段称为引物，他有与含 DNA 酶的靶区 互补的序列，是使特异性 DNA 序列扩增的重要组成部分。热循环的第一步是在高温（94- 98 20-30秒）

11、下进行双链 DNA 的物理分离。这被称为 DNA 变性阶段。在较低温度(50 65C 20-40秒)下，将与靶 DNA 互补的引物退火到每一个单链 DNA 模版上，该步为退火阶段。 PCR 的特异性主要来源于与模版序列完全匹配的引物序列和取决于于引物长度的退火温度。 DNA 多聚酶连接到引物-模版杂交链上开始 DNA 复制。DNA 聚合酶从5到3方向组装合成 一条新的与 DNA 模版互补的链，该步叫延伸。一般来说，几乎所有的 PCR 均需要耐热的 DNA 聚合酶，如最初从嗜热水生菌中分离出的 Tap 聚合酶。结果，它实现了连续重复热循 环程序，即交替的加热和冷却步骤。进行热循环时，合成的 DN

12、A 片段自身作为模版进行复 制，成为一个连续的链式反应，使得 DNA 模版成倍的扩增。 用琼脂糖凝胶电泳的方法根据扩增的 DNA 片段长度（分子量）的不同将其分离。然后 用含 EB（溴化乙定）的溶液处理，EB 是在琼脂糖凝胶电泳中使 DNA 条带可见的最常用的染 料。因为在 UV 灯下 EB 荧光嵌入 DNA 主要的槽中，经 EB 处理后，可见明显的扩增的靶 DNA 片段的条带，进而进行检测。 4.2、巢式 PCR 法原理 图1b 为巢式 PCR 法的基本原理。巢式 PCR 法是改进的 PCR 法，旨在显著增强扩增效率、 减少因非目标引物结合位点扩增引起的非特异性 PCR 产物。尽管普通 PC

13、R 特异性取决于与 靶 DNA 序列结合的引物的互补性，但引物常与其他相似的 DNA 区域结合，产生像引物二聚 体、发夹结构和替代性目标序列这样的不相关的 PCR 产物。巢式 PCR 使用两对引物，应用 于 PCR 的两个连续性步骤中。特别是，第二对引物在首步 PCR 产物中进行再次扩增；这就 是“巢式”这一概念的来源。第 一 对 PCR 引 物 扩 增 片 段 和 普 通 PCR 相 似 。 然 而 ， 第 二 对 引 物 结 合 在 第 一 次 PCR 产 物 内 部 进 行 第 二 步 PCR 产 物 扩 增 ， 第 二 次 PCR 扩 增 片 段 短 于 第 一 次 扩 增 。 巢 式

14、 PCR 的 优 点 在 于 如 果 第 一 步 扩 增 了 不 相 关 或 非 特 异 性 片 段 ， 第 二 次 能 在 错 误 片 段 上 进 行 引 物 配 对 并 扩 增 的 概 率 极 低 。 因 此 ， 巢 式 PCR 是 一 项 非 常 好 的 技 术 ， 他 可 通 过 两 步 扩 增 获 得 足 量 的 靶 DNA， 并 且 他 可 通 过 降 低 非 特 异 性 产 物 的 扩 增 显 著 改 进 靶 序 列 的 特 异 性 。 4.3、 实 时 定 量 PCR 法 原 理 实 时 定 量 PCR 法 是 一 种 变 异 的 PCR 技 术 ， 旨 在 扩 增 并 且 同

15、 时 定 量 靶 DNA 分 子 ； 他 可 进 行 检 测 和 定 量 。 尽 管 实 时 定 量 PCR 法 的 基 本 步 骤 衍 生 于 普 通 的 PCR 法 ， 但 是 其 重 要 特 点 在 于 可 在 反 应 过 程 中 实 时 检 测 扩 增 的 DNA 片 段 。 与 传 统 的 普 通 PCR（ 在 反 应 的 终 末 阶 段 检 测 PCR 产 物 ） 相 比 ， 这 是 一 新 的 革 命 性 的 方 法 .实 时 检 测 PCR 的 两 种 常 用 方 法 如 下 ： (1)用 像 SYBR Green 这样的非特异性荧光染料嵌入任意双连 DNA 中（2）用 像 T

16、apMan 探针一样的序列特异的寡聚核苷酸探针标记荧光报告染料，只有该探针与互补的 靶序列杂交后才能被检测到。前者（SYBR Green）结合包括非特异性 PCR 产物（如引物二 聚体）在内的所有双链 DNA PCR 产物。这是其潜在的缺陷，因为他会影响预期目标 DNA 的 精确定量。 相比之下，像 TapMan 探针这样的荧光报告探针只检测包含互补探针序列的 DNA 片段； 因此，即使出现非特异性的扩增片段，应用这类报告探针依然可以显著增强特异性并且能 精确定量。图1C 所示为基于荧光探针技术(TaqMan PCR)的实时定量 PCR 的基本原理。用荧 光报告染料（如 FAM 或 VIC）在

17、5端标记序列特异性寡聚核苷酸探针，在3端标记共轭 的淬灭染料（如 TAMRA）。荧光报告染料和淬灭染料非常接近，阻止荧光的发散。当反应 被启动时，在 PCR 退火阶段，探针和引物均与靶 DNA 序列退火。当 PCR 反应继续时，Taq 聚合酶的5-3核酸外切酶活性使探针分解，进而使报告集团和淬灭集团分离，导致报告 染料的非淬灭集团放射荧光，该荧光可在激光激发后得到检测。因为荧光报告染料与淬灭 染料的分离方式与 PCR 循环过程有关，所以荧光强度呈指数形式增加。这种增加被用来测 定 Ct 值，以计算每一次反应的扩增率。最终可以精确测量主量 DNA 最新的中枢神经系统结核的 PCR 诊断 5、 检

18、测 M.Tb 的商品化 NAA 法 如今，美国食品药品管理局（FDA）已通过了两中可行的商品化 NAA 法，用于 M.Tb 的 直接检测。如下：罗氏 Amplicor 结核分枝杆菌测试(Roche Diagnostic Systems, Inc., Indianapolis, IN, USA)和基因探针扩增结核分枝杆菌直接(MTD)检测(Gene-Probe, Inc., San Diego, CA, USA)两种检测均用 M.Tb(GenBank accession no. NC 000962.2 (14718461473382)的16S 核糖体 RNA(rRNA)作为扩增的靶序列。16S

19、核糖体 RNA(rRNA)代 表着微生物的稳定属性，被广泛应用于确定分枝杆菌种类。 罗氏 Amplicor 检测应用的是普通 PCR 法。在这种检测试剂盒中用引物对和 M.Tb 特异性的 16S 核糖体 RNA(rRNA)进行扩增和检测。此外，罗氏 Cobas TaqMan MTB 检测是 Amplicor 检 测的改进方法，它采用的是实时(TaqMan)PCR 技术。同时，基因探针扩增结核分枝杆菌直 接(MTD)检测是等温的 RNA 扩增方法。在这种检测试剂盒中，在恒温(43C)条件下通过反转 录酶和 RNA 聚合酶耦合，使 M.Tb 的16S 核糖体 RNA(rRNA)直接扩增，用特异性

20、oligo-RNA 探针杂交方法进行检测。现在，FDA 规定 Amplicor 法只能用于痰涂片阳性的呼吸道标本的 检测。同时，不管 AFB 的痰涂片结果如何，均可应用 MTD 法检测呼吸道标本。有几项研究 报道，在 AFB 痰涂片阳性标本中，两种检测方法均可获得满意的结果（敏感性和特异性均 高于95%） ，但是，应用于 AFB 痰涂片阴性标本时，敏感性降低(60 -85%)。FDA 规定，两种 方法均不能应用于 CSF 的检测。 6、 PCR 技术的临床应用：CNS 结核的诊断 表1总结了用 PCR 技术诊断 CNS 结核的效果。应用 NAA 技术的难点在于 CSF 标本中 M.Tb 的快速

21、诊断，CSF 标本多数来自主要出现在 TBM 中的少数杆菌，还有 CSF 中扩增抑制因子 的出现。在临床实际实践中，诊断 CNS 结核时，PCR 的敏感性和特异性是最为重要的。为 改进 PCR 法的敏感性和特异性，在 CSF 标本里从少数 M.Tb 杆菌中有效提取纯化 DNA 和设置 特意有效的模版引物以扩增 M.Tb DNA 是最为重要的因素。因此，许多研究人员在这些问题 上进行着紧锣密鼓地工作。在20世纪90年代，Shankar、Kaneko、Lin 等人报道许多从 CSF 标本提取和纯化 M.Tb DNA 的改进方法。据这些研究表明，用包含蛋白激酶 K 和十二烷基磺 酸钠（SDS）的细胞

22、溶解液作为表面活性剂处理 CSF 标本，然后从处理后的 CSF 标本中用氛 -氯抽提法和乙醇沉淀法提取和纯化 M.Tb DNA。为更有效的从 CSF 样本中提取出少量的 M.Tb DNA，作者用了高分子量载体 Ethachinmate(Nippon Gene,Tokyo, Japan)和之前报道 的氛氯抽提法和乙醇共沉底法一起作为提取核酸的共沉底剂。然而，在最近的研究中发现， 在临床实验中，不适合用传统的氛氯抽提法和乙醇沉底法，因为这些方法步骤繁琐且非常 耗时。通常情况下，商用柱提取试剂盒（如 QIAmp 血包和 QIAmp DNA Mini Kit，(Qiagen Inc., Valenci

23、a, CA, USA), Cobas Amplicor 呼吸道标本制备试剂盒(Roche Diagnostic Systems, Inc., Indianapolis, IN, USA)）已经在之前的研究中被广泛用来从各种样本中 提取 DNA。然而，在现行的研究中，商用柱提取试剂盒不能从 CSF 标本中提取出 M.Tb DNA；因此，这些广为应用的试剂盒不适宜用来提取 CSF 标本中小量的 M.Tb DNA。 当前，用 NAA 法评估了四种主要的 M.Tb DNA 特异性序列（即 IS6110区插入序列 (Rv3475: GenBank accession no. NC 000962.2 (3

24、8910513892091), 65-kDa 热休克蛋白抗原 (Rv0251c: NC 000962.2(302173302652), 16S rRNA 基因和 MPT64 (NC000962.2 (22233432224029)。在这四种序列区域中，IS6110区插入序列是一个专门在 M.Tb 复合 物基因组中发现的重复性元件，在许多研究中，他已广泛用于有优越扩增效率的靶序列(表 1)。在这些之前的研究中，针对 IS6110插入序列的 PCR 检测用于 TBM 诊断是显示比较好的 效果（总的敏感性为70 98%，特异性为80 100%）（表1）。此外，靠近 IS6110插入序列， 16S r

25、RNA 基因常用于 NAA 检测，并且他是两个商用 M.Tb 检测方法（即 Roche Amplicor 检 测和基因探针 MTD 检测）的靶序列。如前所述，这两种方法检测呼吸道标本已经得到 FDA 认证。现在尚无得到认证的用于 CSF 检测的商用 NAA 方法，但是有研究评价了他们在 TBM 病例中的效果（表1）。最近一项关于商用 NAA 法诊断 TBM 的荟萃分析显示总体的敏感性为 56%，特异性为98%。基于这些研究结果，人们认为商用 NAA 法可能在诊断 TBM 中起一定作 用，但因其敏感性较低，所以不是确诊 TBM 的理想方法。因为不能用这两种商用 NAA 法诊 断 TBM 的主要原

26、因在于其敏感性较差，所以可以认为，他们可以用于检测包含大量 M.Tb 杆 菌的呼吸道标本，但不能用于检测 CSF 样本中的少量 M.Tb DNA。近来有研究表明，改进的 基因探针 MTD 检测可提升 CSF 中 M.Tb DNA 的检测效果。然而，这些改进技术的应用仅限于 单个的实验室，尚未得到广泛应用。同时，MPT64是编码 MPT64蛋白的基因序列，这在 M.Tb 复合物中有特异性，且仅存在于 M.Tb 基因组中的一个位点上，因此，认为 MPT64是 PCR 法 中最具特异性的序列，已经在许多研究中用作 PCR 的靶序列。Lee 等人比较了 IS6110, 65 kDa 抗原和 MPT64

27、三个序列，认为 MPT64是 PCR M.Tb DNA 扩增中最具特异性和敏感性的序 列。 除了商用 NAA 法，应用 PCR 法扩增 M.Tb DNA 已经得到了许多临床上的关注（表1）。 正如上面所描述的一样，为了改进诊断 CNS 结核的 PCR 法，科研人员已经尝试了各种想法。 最近，发明了革命性的巢式 PCR 技术以诊断 CNS 结核，与传统的 PCR 相比，他能显著增加 敏感性和特异性。Liu 等人报道，针对 MPT64序列的巢式 PCR 被用于 CSF 标本的检测，这些 标本来自临床怀疑感染 TBM 的21个患者，巢式 PCR 使得24小时内 TBM 诊断的敏感性为90%， 特异性

28、为100%。此外，他们报道说，巢式 PCR 的敏感性比普通的 PCR 高1000倍。作者从临 床收集了9个高度怀疑 TBM 患者的 CSF 标本用巢式 PCR 法检测了 MPT64序列。在我们的研究 中，巢式 PCR 的敏感性和特异性均为100%，但是普通 PCR 和 M.Tb 培养的敏感性仅为 22.2%。而且，我们检测了巢式 PCR 的最低检测敏感性。巢式 PCR 的检测水平在1-10复制份 数/2 L 纯化的 M.Tb DNA，与传统的 PCR 相比，其敏感性从1000倍提升到10000倍。考虑到 PCR 分析结果和 ATT 反应之间的关系，Lin 等人用普通 PCR、Scarpelli

29、ni 等人用巢式 PCR 分别检测了这种关系。值得一提的是，Scarpellini 等人进行了历时性研究，他们从接受 临床治疗的7名患者中收集了一些 CSF 标本，用巢式 PCR 测定了 IS6110序列。在他们的研 究中，巢式 PCR 结果显示4个 TBM 患者在 ATT 过程中的临床状况转阴。与此相反，没有 ATT 反应的3位患者整个临床过程中的巢式 PCR 结果依然为阳性，最终死亡。因此， Scarpellini 等人认为巢式 PCR 可用于评估 TBM 的临床治疗过程。与此相似的是，在我们 的研究中，从7个高度疑似 TBM 的患者收集 ATT 治疗中的27份 CSF 标本，用巢式 PC

30、R 法进行 检测，其中有11份(40.7%)显示阳性。而且，我们的巢式 PCR 结果显示，在 ATT 中6位患者 的临床状况得到改善，结果转阴。与此相反，从7位接受临床治疗的患者中收集27份连续标 本，用传统的 PCR 和 M.Tb 培养法检测，结果显示为阴性。巢式 PCR 有着优异的敏感度和特 异性，是一种实用的方法。有些疑难病例用普通的 PCR 法很难检测到 M.Tb，而用巢式 PCR 却可以诊断，鉴于此，作者预测，如果该项技术得到合理的广泛临床应用，他将是精确快 速诊断 CNS 结核最有效的工具。 尽管我们都期望在临床上能广泛应用巢式 PCR 法，但令人遗憾的是，现在还很少用于 TBM

31、的诊断。存在的主要争议在于，该法步骤繁多，而且很费时，不适合在临床上作为常 规检测手段。此外，因该法显著增加了敏感性且需要额外的扩增步骤，所以，一般来说会 很容易发生交叉污染。当然，巢式 PCR 不适合对许多样本进行临床常规的甄别检查。然而， 即便可用其他简单方法检查诊断 TBM，但是阴性结果并不能排除感染 M.Tb 的可能性，因此， 用适宜的临床检测手段诊断 TBM 依然是一大难题。在急性临床阶段，CNS 结核需要的不是 甄别性检测而是一个确定性的检查。因此，如果将巢式 PCR 用于从 TBM 高度疑似患者中收 集的明确适当的临床标本中，他应该是一项非常有用的技术。最后，用巢式 PCR 诊断

32、 CNS 结核的另一难点在于他需要配备一个合适的实验室以应用这一精确的技术；就现实情况而 言，在 TBM 高度流行区，常常没有这种条件。这是 CNS 结核诊断中一个至关重要的问题， 需要得到尽快解决。 7、 用于 CNS 结核诊断的 PCR 技术的新进展 最近，为快速诊断 CNS 结核，作者开发了一种新型内控宽量程定量巢式实时 PCR 法 （WR-QNRT-PCR），用于 M.Tb DNA 的检测。该技术既有巢式 PCR 的强敏感性，又有实 时定量(TaqMan)PCR 的精确性。（图2a） 在 WR-QNRT-PCR 中，需准备“野生” (W)和“新突变” (NM)两种原质粒，用来定量检测

33、M.Tb DNA。在 W-质粒中将一个239个碱基对的 MPT64基因片段插入到 pCR 2.1载体中，作为 标准模版（图2b）。NM-质粒在 W-质粒基础上进一步突变，在 iWR-QNRT-PCR 中作为一个新 的内控“校准器” （图2b）。在 NM-质粒中，五个区中包含两对（内部和外部）正向和方 向引物对，和一个 TaqMan 探针退货位点，用人工随机核酸置换这些位点（图2b）。将人工 随机核酸序列设置成与野生 M.Tb MPT64序列核酸组成一致的序列。制备四对特异性引物和 两种特异性 TaqMan 探针，以备用于 WR-QNRT-PCR 中。表2和图2b 显示了这些引物和探针的 序列和

34、位置。对野生 M.Tb 或 W-质粒的 MRT64序列来说，两对正向和反向引物（WF1 和 WR1 两个外部引物用于第一步，TqMn-WF2 和 TqMn-WR2两个内部引物用于第二步）和 TaqMan 探 针(TqMn-W-VIC)是特异的。相比而言，对 NM-质粒中用作新内控“校准器”的人工随机核 酸来说，两对正向和反向引物（MF1 和 MR1两外部引物及 TqMn-MF2 和 TqMn-MR2两内部引 物对）和 TaqMan 探针(TqMn-M-FAM)是特异的。这些引物和探针的核酸组成均设置成一样的， 但是序列不同，是随机分布的（表2）。因此，我们可以认为，这些引物和探针跟野生 MPT

35、64或 NM-质粒的退火效率是相同的。 WR-QNRT-PCR 法包含两步连续的 PCR 扩增，第一步为传统的普通 PCR,第二步为实时 (TaqMan) PCR（图2a）。在该法中，整个程序包括在相同的分析条件下同时提取、扩增和 检测 M.Tb DNA 及作为新内控的 NM质粒，这需要用针对各自模版有着相同退火效率的四 对引物和两个探针。因此，在 CSF 标本中，根据扩增率和新内控校准器（NM 质粒）的关系， 可计算 M.Tb DNA 的起始拷贝量，计算公式如下：X:W = C:M X= W C/M.（X，每毫升 CSF 样本中 M.Tb DNA 的起始拷贝量；C，新内控的起始拷贝量（=“校

36、准器” 10 3NM 质粒拷 贝）；W 和 M，分别为提取和扩增后， M.Tb DNA 和 NM-质粒的拷贝数。）人们普遍认为，在 M.Tb 中，MPT64基因一次拷贝代表一个细菌。因此，我们可认为用 WR-QNRT-PCR 法计算的 拷贝数与 CSF 样本中 M.Tb 的细菌数有关。 WR-QNRT-PCR 法需要两个定量检测 M.Tb DNA 和新内控物 NM-质粒的特异性标准曲线。 在实时(TaqMan) PCR 中，标准曲线的精确度是影响定量检测的首要因素。图2c 和2d 展示 了两个特异性标准曲线。在样本回归分析中，两标准曲线均显示 Ct 值（y 轴）和每一标准 模版的起始拷贝数的对

37、数（x 轴）有显著的线性相关( R2 0.99)。两因素 ANOVA 法显示， 在重复区组实验中两个标准曲线均无显著性差异( n = 10; F = 1.007, P = 0.65和 F = 1.015, P = 0.53)，根据标准曲线的斜率可计算出实时 PCR 的 PCR 效率(Eff)。公式如下： PCR 效率=10 (1/斜率) 1.两个标准曲线的斜率分别为 (3.33 和3.28)，通过该公式可得 PCR 效率(Eff)分别为99.7 和101.8%。这些结果表明，WR-QNRT-PCR 法中， M.Tb DNA 和新 内控物的扩增和检测效率几乎一样。 当将 NM-质粒10 3拷贝数

38、的值设置为新内控的最优拷贝数时，NM-质粒扩增曲线显示作 为模拟 M.Tb DNA 的 W-质粒的所有起始拷贝数（1-10 5）有着显著的统一模式（图2e）。此 外，用单因素 ANOVA 法（图2f），NM-质粒10 3拷贝的 Ct 值显示所有 W-质粒的起始拷贝数 间的均方有统计学意义( F = 1.086, P =0.774)。这些结果表明在整个 PCR 扩增过程中， M.Tb DNA 和新内控之间没有干扰。因此，我们可以认为在 WR-QNRT-PSR 法中，NM-质粒可 作为内控“校准因子）。NM-质粒的发展，使得 WR-QNRT-PCR 法有稳固的统计学意义，使在 宽检测范围（1-10

39、 5）进行 M.Tb DNA 检测成为可能。 作者检测了 WR-QNRT-PCR 法在 CNS 结核的精确快速诊断及其临床过程评估中的效果。 作者收集了1998-2005年间24位 TBM 疑似患者和29位非 TBM 患者的标本。从24位患者中收集 了67份 CSF 样本，在这些样本中，有43份是从10位（3号和8-16号病例）随访超过2周的患 者中得到的连续性标本。表3总结了24位疑似 TBM 患者入院时（在 ATT 之前）的临床特征. 所有的24位患者达到了(A)临床标准并(B)符合 TBM 特征（如表3所述），有8个确诊病例 （1-8号病例）（M.Tb 的 CSF 培养阳性）和16个高度

40、疑似病例（9-24号病例）（符合所有 临床标准，有3个佐证诊断的阳性结果，但是未分离出病菌）。在临床应用中，对这24位临 床 TBM 疑似患者来说，WR-QNRT-PCR 法显示了足够高的敏感性(95.8%)和特异性(100%)。表 3列出了测得的每毫升 CSF 中 M.Tb DNA 的拷贝数。在传统的 logistic 回归中，每毫升 CSF 中 M.Tb DNA 的拷贝数8000,是导致 TBM 预后不良(=死亡)的独立危险因素(OR = 16.142, 95%CI = 1.191218.79, P =0.0365)。在历时研究中，在 10位 TBM 疑似患者的临床治疗 过程中，M.Tb

41、DNA 的拷贝数有显著改变。这10位患者包括2个确诊病例（3号和8号病例） 和8个高度疑似病例（9-16号病例），在从3号和8号患者临床治疗过程所收集的43份 CSF 标 本中，只有3份 M.Tb 培养结果为阳性。相比之下，用 WR-QNRT-PCR 法进行 M.Tb DNA 的定量 检测显示有25份 CSF 标本阳性。此外，有8位患者（8-14号和16号病例）ATT 有效且其临床 分期和常规 CSF 结果在临床疗程中均得到改善， M.Tb DNA 的拷贝数逐渐减少到低于 WR- QNRTPCR 法的检测限（图2g）。然而，在3号和15号病例中，ATT 无效并死于 TBM 恶化，在 整个临床过

42、程中，拷贝数持续增高（图2g）。重复测量 ANOVA 显示，在临床治疗过程中， ATT 有效（8、14、16号病例）和无效（3和8号病例）患者的 M.Tb DNA 拷贝数改变趋势有 着显著差异( P = 0.0041) （图2g）。在11和12号病例中，入院时颅部 MRI 显示多个颅内 局灶性肿物，认为是典型的结核瘤（表4和图2h）。在进行 ATT 过程中，WR-QNRT-PCR 法显 示阴转后，这两个结核瘤病例再次显示无任何脑膜炎症状的瞬态阳性。一般来说，结核瘤 患者常伴有 TBM,当然在无 TBM 的情况下结核瘤也会发生。随访 MRI 显示，这两例结核瘤分 别在 ATT5个月和3个月后消失

43、（表4）。有意思的是，随着结核瘤的消失，WR-QNRT-PCR 结 果显示为完全阴性。作者推断在 ATT 期间，用 WR-QNRT-PCR 法对这两个病例进行 M.Tb DNA 的瞬态检测与结核瘤有关。在结核瘤中存在少量 M.Tb。ATT 可使结核瘤破裂，随着它的破 裂会有少量 M.Tb DNA 渗入 CSF 中，高度敏感的 WR-QNRT-PCR 法可能会检测到这些 DNA.这 些结果表明，在急性临床病例中，可用基于分子的技术和神经放射成像技术相结合的方法 作为诊断 TBM 和结核瘤的强效方法。众所周知，目前尚无有关这两个病例的报道；因此， 我们可认为他们在临床上十分重要。而且，在简单回归分

44、析中显示 M.Tb DNA 拷贝数和 TBM 临床分期显著相关( R2 = 0.597,P 0.0001)（图2i）。这些历时研究结果表明 WR-QNRT- PCR 在评估 TBM 临床过程和 ATT 反应的定量分析时非常有用。众所周知，以前的研究中， 没有对 CNS 结核整个临床过程的 CSF 样本中 M.Tb 的细菌数和 DNA 量的报道。将 WRQNRT- PCR 用于急性临床阶段定量检测 CSF 中 M.Tb DNA，因为把 NM-质粒作为新内控，所以该法 有着显著的精确度和可信度。因此，我们可认为，在 CNS 结核的快速精确诊断中，这是一 种先进高效的方法。 然而，这种新技术尚未广泛

45、用于临床常规检查。可能是 WR-QNRT-PCR 法需要两步连续 扩增，步骤繁杂。因此，作者正在研发新的简易实惠的定量和高敏感技术，使之可以和一 步的标准实时 PCR 发展而来的 WR-QNRT-PCR 法相媲美。这种正在研发的方法结合了全基因 组扩增(WGA) 和实时(TaqMan)PCR 技术。全基因组扩增为少量优质 DNA 扩增成为可能并且 其中的几项技术可用于商品化试剂盒，价格合理。特别值得一提的是，这些应用 WGA 法的 试剂盒采用的是多重置换扩增(MDA)技术，该技术已经应用于许多研究中，实现了基因组的 均衡扩增。MDA 技术是一种优越的方法，该法用 Phi29 DNA 噬菌体多聚

46、酶和随机六聚体引 物实现了基因组 DNA 的持续扩增。在该项研究中，作者用的是基于 MDA 技术的 GenomiPhi V2 试剂盒(GE Healthcare Life Sciences, Uppsala,Sweden)。因为直接用 GenomiPhi V2 试剂盒即可提取和纯化 CSF 中的少量 M.Tb DNA，使其作为模版，WR-QNRT-PCR 法中的第一 步即可省略。现行 WGA 法的改进可显著简化 WR-QNRT-PCR 法。因此，尽管该技术仍有待于 研究，但是我们都期待这种经济的临床检测方法可广泛进行临床实际应用。 如上所述，包括 TBM 在内的 CNS 结核是 M.Tb 感染

47、的最严重形式，会引起死亡和严重 的后遗症。此外，由于 AIDS 流行引起免疫功能不全个体及高龄人群不断增加，再加上皮质 激素等免疫抑制剂的广泛应用，使得 CNS 结核依然是一个严重的临床和社会问题。特别是 在亚洲和非洲这样的不发达国家和发展中国家，有着许多日益加剧的社会问题，如贫困、 人口过多。营养不良等等，这使得包括 TBM 在内的 M.Tb 感染流行，成为一个严重的社会和 人口统计学难题。作者认为我们有必要发展新技术并且使这些技术能够在这些地方应用。 我们所研究的新技术的广泛应用将导致 TBM 早期确诊病例增加进而改善 TBM 的疗效；因此， 他们为这些国家做出了巨大的医学和社会贡献。我们

48、努力开发新的，更为快速、精确、敏 感、简易、实惠且能定量的诊断 CNS 结核的技术，我们希望这种努力有助于改善全球的医 疗护理，特别是在不发达国家和发展中国家。 8、 结论 近期，在快速精确诊断 CNS 结核方面，除了基于细菌学的传统的“金标准”，我们尝 试了各种方法。本文对近期 NAA 法（主要是 PCR 技术）的进展做一综述。特别是巢式 PCR 法的发明，为 CNS 结核的诊断做出了重要贡献。WR-QNRT-PCR 法有内控物并结合了高度敏 感的巢式 PCR 和精确实时定量 PCR,被认为可快速诊断 TBM，尽管如此，该法尚未用于临床 常规检查。这种新技术有高敏感性且能精确定量，不仅能用于 CNS 结核的诊断，还能预测 预后，评估 TBM ATT 过程中的疗效。因此，我们希望该法能广泛用于 CNS 结核急性临床阶 段的诊断。