1、紫外分光光度法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 3.掌握 TU-1901 紫外可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。 二、实验原理 1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择 性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 紫外光：10-400 nm 可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉) 特点：带光谱、分子光谱 应用：定性分析 最大吸收波长; 定量分析：朗伯-比尔定律( 标准曲线法和标准加入法) a.定性分析原理： 吸收曲线：吸收峰的数目、位置、
2、相对强度以及吸收峰的形状 b.定量分析原理： 根据朗伯-比耳定律： A=bc，当入射光波长 及光程 b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度 A 与该物 质的浓度 c 成正比。 定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度 A 为纵坐标，浓度 c 为横坐标的标 准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。 c. 仪器组成部件: 各种类型的紫外 可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、 吸收池、检测器和信号显示记录装置。 2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理： (1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨
3、酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以 蛋白质溶液在 275-280nm 具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在 最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法 测定蛋白质的浓度范围为 0.11.0mg/mL。 (2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同， 所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在 280nm 的光吸收职也不同。据初步统计，浓 度为 1.0 mg/mL 的 1800 种蛋白质及蛋白质亚基在 280nm 的吸光度在 0.33.0 之间，平均 值为 1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准
4、确度差一点。 (3)有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫 外光的物质，在 280nm 处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在 260nm 处的光 吸收比 280nm 更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用 280nm 及 260nm 的吸收差来计算 蛋白质的含量。常用下列经验公式计算： 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260 (A280 和 A260 分别为蛋白质溶液在 280nm 和 260nm 处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量： 蛋白质浓度(mg/mL)=F* A280*D*1/d 其中
5、 A280 为蛋白质溶液在 280nm 处测得的吸光度值;d 为石英比色皿的厚度(cm);D 为溶液 的稀释倍数;F 为校正因子 (4)稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在 200250nm 有强的紫外吸收。 其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用 215nm 可干扰 及光散射，用 215nm 和 225nm 光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引 起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用 215nm 和 225nm 光吸收差法。常 用下列经验公式： 蛋白质浓度(mg/mL)=0.144(A215-A225) (A215 和 A225
6、 分别为蛋白质溶液在 215nm 和 225nm 处测得的吸光度值 三、仪器与试剂 仪器：TU-1901 紫外-可见分光光度计，比色管(10ml 的 5 个)，吸量管。 试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL 溶液、0.9% NaCl 溶液，待测蛋白质溶液(牛血清白蛋白 )。 四、实验步骤 1.基本操作 (1)启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。 (2)用吸量管分别吸取 0.6、0.8 、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL 标准蛋白质溶液于 5 只 10 mL 比色管中，用 0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。用 1 cm 石英比色皿，以
7、0.9%NaCl 溶液 为参比(参比溶液不可取出). (3)在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数(起点：400nm ，终点： 250nm，速度：中，间隔：1.0nm ，单次扫描) (4)将两个均装有 0.9%NaCl 溶液的 1cm 石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选 定量测定，校零，在调回光谱扫描。 2.吸收曲线的制作:(找出最大吸收波长) 将放在前面的比色皿中溶液换为 0.3 mg/mL 的蛋白质溶液，点击 START 进行扫描，得到如 下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为 278nm，此波长 下的吸光度为 0.1984。 3. 标准曲线的
8、制作： 在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件 ( 测量波长： 278.00 nm) 。 用 1 cm 石英比色皿， 以 0.9%NaCl 溶液为参比， 在 278nm 处分别测定以上所配标准溶液的吸光度 A278 ， 记录如下： 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线： 4. 样品测定： 配制三份待测蛋白质溶液， ( 取待测蛋白质溶液 2.0mL 分别于 3 只 10mL 比色管中， 用 0.9% NaCl 溶液 稀释至刻度 ) 按上述方法测定 278 nm 处的吸光度。得吸光度依次为 0.3906 ， 0.3765 ， 0.3848 。平均值为 A278=0.3840,
9、根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为 0.6101mg/mL 。转换后待测 蛋白质溶液的浓度为 C= 0.6101mg/mL 10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL 。 五、注意事项 准备工作： (1) 在测量前应把机器预热半小时。 (2) 溶液一定要配制准确 , 以防影响实验效果 , 保证点在一条直线上。 (3) 由于蛋白质的紫外吸收峰常因 PH 值的改变而改变，故进行样品测定时的 PH 最好与标准曲线制作 时的 PH 值一致。 测量工作： (1) 吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。 (2). 在作标准曲线进行 定量前 一定要选择最大的吸收波长 , 确保灵敏度高
10、。 (3) 在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影 响通光。 六、思考题 1. 紫外分光光度法测定蛋白质的方法有何缺点及优点 ? 受哪些因素的影响和限制 ? 答：优点：方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备，不消耗样品，测定后仍能回 收使用，低 浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测定。 缺点：准确度和灵敏度差一点。干扰物质多：对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨 酸含量差异 较大的蛋白质，有一定的误差。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会产生较 大干扰 2. 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正 ? 答： 因为核酸在 260nm 处的光吸收比 280nm 更强， 但蛋白质却恰恰相反， 因此可利用 280nm 及 260nm 的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算： 蛋白质浓度 (mg/mL)=1.45A280-0.74A260 (A280 和 A260 分别为蛋白质溶液在 280nm 和 260nm 处测得的吸光度值 ) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量： 蛋白质浓度 (mg/mL)=F* A280*D*1/d 七、实验总结 本次实验进行得很顺利，绘制标准曲线时各个点都落在直线上，实验达到了预期的目的
