毛细管电泳及其应用.docx

1、毛细管电泳及其应用 摘要：毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis, CE)，是近二十年来发展最为迅速的新型液 相分离分析技术之一。CE 实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是继高效液相色谱 之后的又一重大进展，具有分离效率高、简单、经济、快速和微量、自动化程度高等优点。 毛细管电泳这些特点使其成为一种极为有效的分离技术，目前已是生命科学及其它学科中 一种常用的分析手段，已广泛应用于蛋白质、氨基酸、无机离子、有机化合物等的分离分 析。 关键词：毛细管电泳，分离效率高，生命科学 引言 毛细管电泳是在传统电泳技术的基础上逐步发展起来的。电泳技术的出现可以追溯到 100

2、 多年前 1。1807-1809 年，俄国物理学家 F.F.Reuss 首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并 开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。起初电泳只是作为一种 物理化学现象来研究。电泳真正意义上进入分析化学被视为一种重要意义的技术，是在瑞 士化学家 Tiselius2公布了移动界面电泳技术的细节之后。他首先将电泳现象成功的应用于 人血清的分离，获得了多种血清蛋白，他制成第一台电泳仪，并进行自由溶液电泳。 Tisedius 对电泳技术的发展和应用所做的巨大贡献，使他获得了 1948 年诺贝尔化学奖。但 是传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。1967 年 H

3、jerten3最先使用慢速 旋转的内径为 3 mm 的石英玻璃管进行自由溶波电泳，以 UV 进行检测，成功地分离了蛋白 质、多肽、无机离子、有机离子等，Hjerten 最早证明可以把高电场用于细内径的毛细管电 泳，但他没有完全克服传统电泳的弊端。1974 年 Virtanen 提出使用细毛细管提高分离效率， 阐明电渗流就像泵一样可以驱动液体流过毛细管，并说明了使用更细内径的毛细管做毛细 管电泳的特点。1979 年 Everaerts 和 Mikkers4使用内径为 200m 聚四氟乙烯毛细管，提高 了毛细管的分离效率，成功分离了 16 种有机酸。1981 年 Jorgenson 和 Lucka

4、s5发表了划时 代的研究工作，采用内径为 75m 石英毛细管进行实验，采用高电场电迁移进样，以灵敏 的荧光检测器进行检测，使丹酞化氨基酸高效、快速分离，首次获得理论塔板数高达 4x105/m 的柱效。 Jorgenson 和 Lucas 等人的开创性工作，使 CE 发生了根本性的变革，标志 着 CE 从此跨入高效毛细管电泳时代。 1983 年 Hjerten6将毛细管的内壁填充聚丙烯酰胺凝胶并将其用于毛细管电泳分离，发 展了毛细管凝胶电泳(CGE) 。 CGE 具有极高的分辨本领。凝胶作为支持介质的引入大大促进 了电泳技术的发展，可用于蛋白质碎片的分离及 DNA 序列的快速分析。 1984 年

5、 Terabe 等 7将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支胶束电动 毛细管色谱(MECC)。他首次将表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)加入缓冲液中，在溶液中形 成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，目前，MEKC 己成为应用非常广泛的电 泳模式之一。1985 年 Hjerten8等把平板等电聚焦电泳过程转移到毛细管内进行，发展了等 电聚焦毛细管电泳(CIEF)。他是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添 加剂的混合物注入毛细管内 9，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解质可以在 管内形成一定范围的 pH 梯度，从而达到使复杂样品中各组分分离的目的。1987

6、 年， Karger 等 10对凝胶填充技术进行了改进，优化了 CGE 技术,极大提高了其分离效率并阐明 了用小内径毛细管可进行毛细管凝胶电泳。同年 Smith 等 11将毛细管通过电喷射接口与质 谱相连，从而实现了质谱和毛细管电泳联用的检测法，毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术以 其高效及高准确性被广泛应用于很多领域。 毛细管电泳根据分离机理和介质不同，具有多种分离模式，每种模式的选择性不同。 毛细管电泳现有以下六种经典分离模式：毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)， CZE 是毛细管电泳中应用最广泛的一种分离模式，CZE 用以分析带电溶质，其

7、分离机理是基 于各被测物质的净电荷与质量之间比值的差异，粒子以不同的速度在分立的区带内进行迁 移而被分离。CZE 的特点是操作简单、快速、应用范围广，从理论上讲适用于分离所有具 有不同淌度的荷电粒子，其广泛应用于蛋白质、氨基酸、多肽、对映体拆分和其它带电物 质的分析。 胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC)，MECC 是 指在缓冲液中添加表面活性剂( 如十二烷基硫酸钠，SDS)，当添加剂浓度超过临界胶束浓度 后，就形成了胶束。被分离物质在水相和胶束相(准固定相 )之间产生分配，并随电渗流在 毛细管内迀移

8、，达到分离。MECC 是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离技术，既能用于 分离中性物质又能分离带电组分，主要用于分析手性对映体和药物小分子等。常用的表面 活性剂有各种阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子和两性表面活性剂、混合胶 束(如阴离子表面活性剂和胆酸盐组合混合胶束) 。 毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis, CGE)，CGE 是 80 年代后期发展起来的毛 细管电泳的主要分离模式之一，它的原理是把单体装入到毛细管中引发聚合形成凝胶作支 持物进行的电泳。凝胶具有多孔性结构，能够起到类似分子筛的作用，当带电溶质在电场 作用下通过凝胶的多孔性结构时，

9、将会因溶质分子大小不同而产生不同的阻力，溶质按分 子大小逐一分离。CGE 将毛细管电泳的快速和微量分析与凝胶电泳对生物大分子的高效分 离能力相结合，发展为当今分离度极高的一种电泳分离技术。尤其对那些荷质比不随分子 大小而变的大分子如 DNA、蛋白质，CE 其他分离模式很难对其分离，采用凝胶的筛分作用 就能获得良好分离。而且凝胶能减小溶质的扩散，所得峰型尖锐，能达到 CE 中的最高柱效。 CGE 在 DNA、RNA 片段分离和排序、原蛋白和结合蛋白的分离及 PCR 产物分析中有着十分 广阔的应用。聚丙烯酸胺作为最常用的单体在毛细管内交联生成凝胶，但其使用寿命短、 制备比较烦琐。 毛细管等电聚焦(

10、Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)，CIEF 为毛细管里进行的等电聚焦电 泳过程。它是结合了传统等电聚焦和毛细管电泳高效、快速、微量等优点，根据溶质的等 电点(pi) 不同而进行分离的技术。其基本原理是将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将 分析样品和两性电解质溶液混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，加高电压后， 在毛细管内壁建立 pH 梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点时呈电中性，不再移动， 产生非常窄的聚焦带，并使不同等电点的溶质聚焦在不同位置上而相互分离。聚焦后，改 变检测器末端电极槽储液的 pH 值或用压力使溶质通过检测器。 CIEF

11、有非常高的分辨率， 可以分离等电点差异小于 0.01pH 单位的两种蛋白质。CIEF 己经成功用于测定蛋白质等电点， 蛋白质、多肽的分离分析，异构体分离等方面。 毛细管等速电泳(Capillary Iso-TachoPhoresis, CITP)，CITP 的基本原理是将两种滴度差别 很大的缓冲体系分别作为先导电解质和后继电解质，带不同电荷的被分析组分按其电泳淌 度不同迁移至各个狭窄的区带，得以分离。这种分离模式主要用于离子型物质的分离。 CITP 具有界面明显、富集、浓缩的特点,所以现在常用作柱前浓缩方法用以富集样品，以解 决 CE 测定中灵敏度不高的问题。 毛细管电色谱(Capillary

12、 Electro Chromatography, CEC)，CEC 是一种比较新颖的分离分析 方法。它是将高效液相色谱(HPLC)的细粒径固定相微粒填充到毛细管中，或在毛细管内壁 涂布固定相，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流(或电渗流结合高压输 液泵)为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的优势，因为采用柱塞流来 推动流动相，克服了高效液相色谱中用压力驱动流体，流速不均匀引起的峰扩展，因而使 毛细管电色谱的理论塔板数远远高于高效液相色谱，能达到接近于 HPCE 的高理论塔板数， 虽然其柱效相对 HPCE 有所下降，但是由于引入了高效液相色谱的固定相，使毛细管电色 谱

13、具备了固定相所具有的高选择性，使它不仅能分离带电物质，也能分离中性化合物。 CE 的装置比较简单,由高压直流电源、进样系统、分离毛细管和检测器构成，前三个部 件均易实现。CE 采用了极小内径的分离毛细管虽然带来了很高的分离效能，但同时进样量 也很小，对检测技术的灵敏度相应提出了较高的要求。检测器是毛细管电泳仪的关键部件， 为了适应 CE 微体积检测的需要, 在检测器方面已开展了大量而有意义的研究。目前，原子 吸收光谱、电感稱合等离子体发射光谱及红外光谱还未被用做 CE 的检测器。目前在 CE 检 测中应用较多并且己经商品化的光学检测器主要包括紫外可见(UV-Vis)、荧光、化学发光、 拉曼光谱

14、等以激光为光源的检测器。其中 UV-Vis 装置简单、操作易行、灵敏度适中是 CE 常用的检测方法。因为大多数有机分子在较低的紫外可见波长范围内都有吸收，所以 UV- Vis 检测是 CE 中应用最广泛的一种检测方法。检测方式可分为波长固定或可变的检测器和 二极管阵列或波长扫描检测器两类。前一类检测器采用滤光装置来选取所需检测波长，结 构简单，灵敏度比后一类检测器高；但是后一类检测器能提供关于时间-波长-吸光度的三 维图谱。荧光检测器是 CE 中使用的第二大类已成熟化、商品化的检测器。主要包括采用氚 灯、氙弧灯和钨灯作为激发光源的普通荧光检测器和用氦-镉激光器和氩离子激光器作为激 励源的激光诱

15、导荧光检测器(LIF) 12,13。荧光检测法其实也是毛细管电泳中一种“在柱”检 测法，因其对分析物区带不会引起额外的展宽，所以该检测器的灵敏度和选择性都很高， 尤其是 LIF，其灵敏度可高达 10-12-10-15mol/L，是目前毛细管电泳中灵敏度最高的一种检测 方法。在众多检测方法中，电化学检测以其检测灵敏度高、线性范围比较宽、选择性好、 仪器简单、价格低廉以及可避免 CE 中光学类检测器遇到的光程太短的问题而得到了广泛的 使用。毛细管电泳-质谱联用技术(CE-MS)由 Olivares14于 1987 年首次报道，它将 CE 溶剂用 量少，分析速度快及分离效率高等优势和质谱(MS)能提

16、供组分结构信息，具有较强的定性 功能的优势结合起来，提供了一种样品分离和鉴定相结合的强有力的方法。 随着人们生活水平的提高以及科学技术的发展，食品的种类和数量日趋增多，消费者 对食品营养和安全越来越关注。食品安全通常是针对食品质量而言，主要是指食品中不应 含有可能损害或威胁人体健康的有毒、有害物质或因素。近年来，国内外食品安全恶性事 件不断发生，食品安全问题已引起全世界的广泛关注，食品分析技术因而得到了更多的重 视。但是食品分析存在了一些困难，比如：食品多样性及样品基质背景复杂、被测成分浓 度较低、前处理过程繁琐，因此建立一种高灵敏度、高选择性、简便、快速、可靠、低成 本的分析方法己成为食品安

17、全检测中分析测试技术的研究方向。食品安全检测现已采用以 仪器分析为主的分析技术。常用的分析方法有薄层色谱法、气相色谱法(GC)、高效液相色 谱法(HPLC)、原子吸收分光光度法、红外吸收光谱分析技术、毛细管电泳、核磁共振等。 目前，HPLC 和 GC 这些色谱技术已经相对成熟，使用较多。尽管 HPLC 和 GC，但是它们在 使用时都有一定的限制。GC 法只能分析化学性质稳定而且易挥发的物质。 HPLC 虽然可以 分析不易挥发或者化学性质不稳定的物质，但是 HPLC 色谱柱昂贵，运作成本较高，流动 相的选择受到了一定限制，与快速、灵敏、方便的分析科学发展要求还是有一定的差距。 有时一种分析技术还

18、不能满足要求，需将几种方法结合起来，起到方法间的互补作用，如 气相/ 质谱(GC/MS) 、液相/质谱(LC/MS) 等联用技术有着巨大的潜力，但是目前还不是很成熟。 CE 是一种新型分析技术，兼有电泳和色谱技术的双重优点，具有多组分可同时测定、 高效、高速、高灵敏度、高自动化等一系列优点，适合于痕量分析，特别是对样品提取、 浓缩、纯化和衍生等前处理过程无严格要求，同时 CE 具有多种不同的分离模式，在分析复 杂食品成分时有更多的途径可以选择。通过建立和优化分离方法，CE 就可以广泛应用于食 品安全检测之中，在食物中毒等突发公共卫生事件中鉴定有毒有害物质的应用将显示其巨 大的潜力，己引起生命科

19、学、食品科学等各领域的极大重视 15,23。 参考文献 1Hjerten S, Zhu M D. J. Chromatogr., 1985, 346: 265 2Tiselius A. Trans. Faraday Soc.,1937,33: 524 3Hjerten S. Chromatogr. Rev., 1967, 9: 122 4Mikkers F E P, Everaerts F M, et al. Chromatogr., 1979,169: 317 5Jorgenson J W, Lukacs K D. Anal. Chem.,1981,53: 1298 6Hjerten S.

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