细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响(实验设计).doc

1、 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 1 【实验目的】 1细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响。 2. 熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。 3了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。 4了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。 【实验原理】 1. 滋养层细胞的制备 在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或 培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是滋养 层细胞

2、。至于滋养层细胞可以促进其它细胞生长的原理目前有两种解释：一种解释是滋养层 细胞可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用；另一种解释是滋养层细胞可以释放出一些 必要的生长因子，可以促进目的细胞的生长。在单抗制备过程中，刚刚融合的细胞和克隆化 的细胞都比较难以生长，因此都需要添加滋养层才能较快地生长。 在介绍滋养层细胞之前，先来介绍一下制备单抗的培养基体系。 RPMI 1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute Medium 1640） RPMI 1640 培养 基（下面简称 1640）最初是 Roswell Park Memorial Institute 用

3、来培养人的淋巴细胞的培 养基，后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中。商品化的 1640 大多以固体形式出售， 也有少数是配好的液体。有的商品化 1640 中不含碳酸氢钠（稳定 pH 作用）、不含 HEPES（稳定 pH 作用）、丙酮酸钠（提供碳源）、谷氨酰胺，配制前需要仔细阅读说明书， 按照说明书的要求加入需要额外加入的成份，尤其是谷氨酰胺，它是细胞增殖必不可少的成 份，而且谷氨酰胺特别容易分解，配制完培养基后应该尽快用完，暂时不能用完的放在 4 或者-20保存。大部份商品化的 1640 培养基中都含有酚红作为酸碱指示剂，1640 的 pH 为 7.2-7.4，指示剂显示为红色（如果偏酸则

4、显黄色，偏碱则呈紫色）。 DMEM 培养基（Dulbeccos Modified Eagles Medium） 是在 Basal Medium Eagle 的基础 上改进的，最初用于鼠胚胎细胞的培养，后来广泛地应用于各种贴壁细胞的培养或者发酵罐 培养。与 1640 培养基相比，DMEM 培养基营养更为丰富。DMEM 培养基有两种类型，一种是高 糖型，主要用来培养高密度悬浮细胞，另一种是低糖型，主要用来培养普通的贴壁细胞。与 1640 培养基一样，商品化的 DMEM 培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定的成份。 由于单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞，因此上述两种培养基都可以用

5、 来培养杂交瘤细胞。但是这些培养基并不能直接使用，而在使用之前需要加入 15%-20%胎牛 血清（推荐使用 Hyclone 公司、Gibco 公司或四季青公司胎牛血清），胎牛血清可以为细胞 提供更多的生长因子和激素等活性物质，添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基，否则称 作不完全培养基。在单抗制备中，由于需要进行选择性杀死非目标细胞，所以使用添加 HAT 的选择性培养基，通常 HAT 中，H（次黄嘌呤）的浓度为 110-4M，A（氨基蝶呤）为 410- 7M，T（胸腺嘧啶）为 1.610-5M，在 HT 培养基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同 HAT。另 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程

6、开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 2 外，在细胞培养中，一般都加入抗生素防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/ml） 和链霉素（100ug/ml）、四环素(50ug/ml)、庆大霉素（50ug/ml），其中青霉素和链霉素联 合使用较为常用，俗称“双抗”。由于细胞培养中几乎所有的成份对高温都不稳定，所以绝 对不能使用高温灭菌，而是采用 0.22um 滤膜过滤除菌。通常，先配好不完全培养基（要加抗 生素），然后在超净台上抽滤、分装，取少量分装的培养基加入至液体 LB 培

7、养基里 37培 养过夜进行无菌测试，其它的培养基则放在-20保存。确认培养基无菌后才能使用。 HT、HAT 则配成相应的母液（可用 PBS 配制，也可以用不完全培养基配制，一般配为 50浓 度保存）。培养基使用前根据需要加入 HAT 或 HT 以及血清才可以使用。 脾脏细胞。脾细胞与杂交瘤的来源细胞上有很高的同源性，因此与杂交瘤的“兼容性”较 好，是作为滋养层的不错选择。其制备方法和腹腔巨噬细胞过程类似，只是需要剪开腹膜， 取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在 200 目不锈刚细胞筛网上，用 5ml 注 射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器（建议使用一次性培养皿

8、， 养细菌用的那种比较便宜），用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，收集离心，计数稀释 同腹腔巨噬细胞制备过程，一只老鼠的脾脏细胞总数约为 2108-3108个，以 96 孔为例， 每孔需要约 1105个脾细胞。 其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好 四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹 住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，剪开腹膜，取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将 脾脏放在 200 目不锈刚细胞筛网上，用 5ml 注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛 网落入下面的容器（建议使用一次性培养皿，养细菌用的

9、那种比较便宜），用少量不完全培 养基冲洗、吹匀脾细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞 1200RPM 离心 5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基（用于刚融合的细胞需要加 HAT，用于克 隆化的细胞需要加 HT），用巴氏管反复吹打均匀，可用血球计数板计数（一只老鼠的脾脏细 胞总数约为 2108-3108个，以 96 孔为例，每孔需要约 1105个脾细胞）。稀释好后，用 巴氏管吸取此滋养层细胞按合适的体积滴到 96 孔板或 24 孔板上（平均每只老鼠的脾脏细胞 可铺两至三块 96 孔板）。滋养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。 需要指出的是，滋养层并

10、不是培养杂细胞一定必须的，但是它确实可以在很大程度上提高 细胞的成活率、加快细胞生长速度，因此强烈推荐使用滋养层。 2. 细胞原代培养技术 细胞培养(cellculture) 是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其 在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为 广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程 等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物 性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系

11、年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 3 胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学 和生物因素对细胞结构和功能的影响。 细胞培养可分为原代培养和传代培养 2 种情况。所谓原代培养(primary culture)是指直 接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。 在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株(cell strain)这两个容易 混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞 系来

12、源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物 学性状不同的细胞群体所组成；而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培 养物或细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持 续存在。 细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细胞在体外的生 长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响，故细 胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、pH 值调整、温度调节 等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。 3. 细胞传代培养技术 传代培养(su

13、bculture)是体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以 便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层 汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取 出，以 1:2 或 l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 4. 细胞的的冻存和细胞的复苏 在低于-70 度的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此， 采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。 当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。 冻存：将

14、体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷 冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70 度的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的 过程。 复苏：是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目 前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加 上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成 造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间 内即融化，避免由于缓慢融化使水

15、分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 5. MTT 法 MTT 法：MTT 法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的体外抗癌药物敏感性 的测试方法，目前已被广泛用于抗肿瘤药物体外筛选实验。其作用的基本原理如下：活细 胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化 3 -（4,5 - 二甲基噻唑 - 2）- 2,5 - 二苯基四氮唑 3 -（4,5 - dimethylthiazol - 2yl） -2,5 - diphenylterazolium bromide, MTT为蓝紫色的不溶于 水的甲臜（formazan ），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲臜的多少 可通过酶标仪测

16、定其在 570nm 处的吸收度（OD 值）而得知，因此可根据 OD 值推测出活 细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 4 其特点：MTT 法是一种检测细胞活性的方法。与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种 常规方法-细胞计数法和同位素掺入法相比， MTT 法具有操作简便、快速、准确、廉价及 不使用同位素等优点，广泛用于生物医学的诸多领域，包括抗癌新药的体外筛选和抗癌药 物相互作用的研究。 【实验

17、材料】 1. 器材：试管，吸管，橡皮头，培养瓶（都须彻底清洗，烤干，包装好，灭菌后备用）倒置 显微镜，酒精灯，酒精棉球，试管架，CO 2细胞培养箱，灭菌工作服，口罩，帽子，超净 工作台，镊子，注射器，筛网，离心机，巴氏管，血球计数板，大头针，二氧化碳培养箱， 眼科剪，眼科镊，培养皿，培养瓶，离心管，微量加样器，吸管，酒精灯，培养基，盖玻 片，滴管，显微镜，恒温水浴箱冰箱（4、-20、-70） ，培养箱，液氮，冰箱，吸管 （弯头、直头） ，废液缸，移液管（10ml） ，冻存管（12ml） ，微量加样枪，医用橡皮膏， 移液枪，酶联免疫检测仪，摇床。 2. 试剂：PBS，0.25%胰蛋白酶，0.02

18、%EDTA 钠盐液，DMEM 液，3%谷氨酰胺，小牛血清， 7.4%NaHCO3，1 万单位/ml 青、链霉素溶液，0.5%台盼兰染液，D-Hanks 液，小牛血清， 培养液双抗（青霉素、链霉素）胰蛋白酶（0.08%） ，1NHCl ，7.4%NaHCO3，DMSO 或无色 新鲜甘油，MTT(5mg/mL),二甲基亚砜。以上试剂均需分装，包扎好，灭菌后备用。 3. 材料：小鼠若干 【实验步骤】 0. 总纲：（1）制备滋养层细胞，供脾脏细胞传代培养用 （2）制备脾脏细胞，加入到有滋养层细胞的培养皿中，进行传代培养 （3）传代后的脾脏细胞分为两组： A 组进行细胞冻存，冻存时间分别为：5h，15h

19、，2d，7d，14d B 组用 MTT 法测定细胞活性，并记录下细胞形态。 （4）A 组冻存的细胞经过复苏后分别用 MTT 法测定细胞活性，并记录下细胞形态。 与 B 组做比较，得到细胞冻存时间对脾脏细胞的影响。 1. 制备滋养层细胞 （1） 杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟 （2） 取出小鼠放在解剖盘上，用大头针固定好四肢，在超净工作台上用一个镊子挑起腹 部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，剪开腹膜，取出脾脏。 （3） 用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在 200 目不锈钢细胞筛网上，用 5mL 注射 器的针芯挤压脾脏，使分散的额细胞通过筛网落入下面的容器，用少量不完全培养 基

20、冲洗、吹匀脾细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。 （4） 将取出的细胞用离心机以 1200r/min 离心 5min （5） 去掉上清液，向沉淀中加入适量的完全培养基，用巴氏管反复吹打均匀， （6） 稀释好后，用巴氏管吸取此滋养层细胞按合适的体积滴到 96 孔板血球计数板上计 数。 （一只小鼠的脾脏细胞总数约为 2*10-3*8108个，以 96 孔为例，每孔需要约 1*105个脾细胞） ，确认稀释的倍数是否正确。 （7） 稀释后制成的细胞悬液即为滋养细胞 （8） 将得到的滋养细胞悬液加入到培养皿中，作为脾脏细胞的滋养层（此步需要接着滴 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2

21、010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 5 加脾脏细胞，实验前要计算好时间） 2脾脏细胞的原代培养 （1）取材 取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于 75%酒精中灭菌 3 分钟。取出转入超净 工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用 PBS 液自上而下冲洗 12 次。转入无菌玻璃培养皿，待用。 （2）分离脾细胞 用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入 PBS 液 30 滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取 PBS 液 0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注

22、射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开） 。 用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的 PBS 液冲脾 脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置 12 分钟。 吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入 Eppendorf 管，并使量至 1ml，以 3000r/分离 12 分钟。 （3）培养脾细胞 超净工作台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml） ”加入细胞培养液 2ml，并在皿盖上画上标 记，加入第一步制得的滋养层细胞，待用。 取上述离心后的 Eppendorf 管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用“枪（200l） ”吸取塑 料皿中的培养液 400ml 加入弃去上清液的 Ep

23、pendorf 管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后 吸取 200ml 脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入 37、5%二氧化碳培养箱 中培养。 3，脾脏细胞的传代培养 (1) 配置营养液 DMEM 液 90% 小牛血清 10% 双抗 100 单位/ml 3%谷氨酰胺 1ml 7.4% NaHCO3 调 pH 至 7.0-7.2 （2）用 75 %的酒精擦拭双手，取出待传代的细胞。移去培养皿中的旧培养基，加入 5 mL PBS 清洗残余的旧培养基，清洗两次，移去 PBS。 （3）向皿中加入适量 0.25 %的胰酶和 0.02 %的 EDTA 溶液进行消化。 消化过程：在上述瓶中加入适

24、量消化液（0.02%EDTA 和 0.25%胰蛋白酶液各一半）以盖满细胞 为宜，置于室温，停留 2-3min 后，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙（针孔大小的空隙） ，如 出现空隙，即可倒去消化液，如未出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直至出现缝隙。 倒去消化液，加入新配置的营养液 3ml，以终止消化。用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复 吹打瓶壁上的细胞层，直至瓶壁细胞完全脱落。继续轻轻吹打培养基，以使细胞散开。随即 补充营养液并以 1：2 或更高比例分装。 （4）将分装好的细胞瓶做好标记，注明细胞代号、日期、置于培养架上，轻轻摇动，以使细 胞均匀分布，以免细胞堆积成团，然后置于含 5 % CO

25、2，37细胞培养箱培养。 （5）观察：细胞培养 24h 后，即可进行观察，主要观察：细胞是否被污染，主要观察培养液 颜色的变化及浑浊度。培养液正常情况下为桃红色；颜色变黄时，必须换液。真菌污染较为 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 6 多见，大多形成白色或浅黄色小点浮于培养表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝 状，管状，树枝状菌丝，此时，培养液透明。 观察细胞是否生长，如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。对

26、数生长期的细胞特点：细胞透明，颗粒少，细胞界限分明，细胞核隐约可见。细胞占瓶壁有 效面积 25%-75%以内，有新生细胞；75%-95%时细胞排列紧密，有空隙；95%以上，细胞致密， 透光性好。 4. 细胞冻存及复苏 （1）制备冻存液 a配制含 10%DMSO 或甘油、1020%小牛血清的冻存培液 b取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的脾脏细胞则直 接将细胞移至 15ml 离心中； c离心 1000r/min，5min； d.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀， 计数，调节冻存液中细胞的最终密度 5106/ml110 7

27、/ml； e.将细胞分装入冻存管中，每管 11.5 ml； (2)冻存过程 a先将冻存管放入 4冰箱，约 40min。 b.接着置于-20冰箱，约 30-60min。 c.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 d.置于液氮罐中长期保存。 （e）同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 (3) 复苏过程 a.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37温水中，并不时摇动令其尽快融化。 b.从 37水浴中取出冻存管，在超净台处打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴 加 10 倍以上培养液，混匀； c.离心 1000r/min，5min； 5.MTT 法测定细胞活性 （1）接种细胞 A用

28、胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。 B离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。 C将细胞稀释至 2.5103-50103 个/ml，每个微滴定板可容纳 20ml 细胞重悬液。 D用加样器在平底 96 孔板中间十列的各孔中加入 200l 细胞悬液，每孔加 0.5103-10103 个细胞。 E将 200l 培养基加至第 1 列和第 12 列的 8 个孔中。第 1 列作读板议的空白对照。 F.将培养板放至塑料饭盒中，于 37湿润环境中温育 1-3 天，等细胞进入指数生长期时可加 入药物。 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学

29、八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 7 （2）待细胞到达对数期后，小心吸去上清液，加入 90l 新鲜培养液，再加入 10ul MTT 溶 液，继续培养 4 h 弃上清，每孔加入 100ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。 （3）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ，对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基 亚砜） 。 （4） 将八个孔的吸光值平均，得到其吸光值。 （5）A 组的 5 个实验组与 B 组做比较，通过其吸光值

30、的大小来判断细胞的活性，从而判定细 胞新陈代谢的状态。 【预期结果】 冰冻的细胞与正常细胞的活性基本无差别，因为处于冰冻状态的细胞新陈代谢基本停止，待 复苏后才恢复正常，类似于动物中的隐生。 【注意事项】 1. 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用 75乙醇消毒。操作前 2030 分钟起动超净台吹风。 2. 操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、 镊子等去拿。 3. 培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口 都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上

31、瓶 塞，才能拿到超净台外。 4. 使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮头， 然后再去吸取液体。在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。 5. 消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞脱落流失。 6. 消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好， 细胞易流失。不同细胞对消化反应不同。 7. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期 细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 8 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 9 冻存和复苏最好用新配制的培养液。 10. 使用

32、DMSO 前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌会破坏其分子 结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO 对人体有害，故在配制时最好戴上手套操 作。 11. 不宜将冻存细胞放置在 0-60这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温 度区内，是“危险温区” 。 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 8 12. 注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 13. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存 管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 14. 冻存液的问题：二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基 亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在 1-2min 内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢， 会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。 15. 离心前须加入较多培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，加入培养液可稀释其浓 度，以减少对细胞的损伤。