1、综述 细胞色素c (cyt-c)是生命体中一种重要的水溶性氧化还原血红蛋白，整个分 子由一条肽链包裹着一个血红素(中心卟啉铁)组成，广泛存在于原核生物和真 核生物细胞的线粒体内膜上，是生命体内氧化还原反应电子传递中的一个环节。 近年来，以cyt-c 为代表的氧化还原蛋白质和酶的直接电化学研究引起了很多研 究者的兴趣，这些研究不仅能获得其内在的热力学和动力学性质的重要信息， 而且还可以促进电极物质与具有高催化和传感性的生物大分子结合，这对于了 解生命体内的物质代谢和能量转换，了解生物分子的结构和各种物理化学性质、 探索其在生命体内的生理作用及作用机制、开发新型生物传感器等都有重要意 义。然而许多
2、在生物体内具有氧化还原性质的蛋白质在金属电极上的电化学反 应是十分不可逆的，所以人们更加关注生物大分子在电极上的直接电化学反应。 由于cyt- c分子较小，对其结构己了解得比较清楚，因此，对cyt-c的直接电化学 研究进行得最早，有关的报道较多。 1.1 cyt-c的结构 cyt-c 分子的形状近似于球形，直径约为 34 ，其外表面分布着许多带电的 氨基酸残基，使得其在中性条件 pH 下带有九个净正电荷，而且 cyt-c 分子表面 电荷的分布是不均匀的，靠近血红素裂隙的一侧分布着一系列赖氨酸残基，带 正电荷，而远离血红素裂隙的一侧带有负电荷，这种表面电荷的非均匀分布对 cyt-c 分子与电极表
3、面或其它分子之间的电子传递具有重要的影响。根据血红素 铁的价态不同，可将 cyt-c 分为氧化性 cyt-c 和还原性 cyt-c，其中血红素侧链和 蛋白质之间是以共价键结合，不同来源 cyt-c 的蛋白质部分略有不同。cyt-c 是 生物氧化的一个非常重要的电子传递体。还原型参与接收自氢脱下的质子，氧 化型参与传递电子给氧，从而促进氢和氧的结合，加强体内代谢物质的氧化供 能反应。其结构为： Cyt-c 结构 Cyt-c 的平面结构图 1.2 cyt-c在电极上的电化学反应 为了揭示cyt-c 在生物体内可逆的电子传递反应的实质，人们模拟其在生物 体内的微环境，开展了cyt- c直接电化学的研
4、究。 (l) cyt-c在金属电极上的电化学反应 虽然cyt-c在生物体内能进行可逆的电子传递反应，但其在金属，如 Hg、Pt、Au、 Ag等电极上的电化学反应却是不可逆的。一般认为这是由于 cyt-c 在金属电极上发生强烈吸附使cyt-c 变性，而变性的cyt-c的电化学反应是不可逆 的1,2。Hawkridge等3认为经过冷冻干燥后的cyt-c 中存在部分cyt-c的低聚物。 这些低聚物易在电极表面吸附。因而阻碍了电极与cyt-c分子之间的电子传递。 (2) cyt-c在媒介体修饰电极上的电化学反应 为了克服上述困难，一些研究组开始考察细胞色素c在媒介体存在下的间接 电化学反应。媒介体是一
5、种能加速细胞色素c氧化还原反应的物质，但其身在所 研究电位范围内也发生电化学反应，如甲基紫精、黄素腺嘌呤二核甘酸等。显 然，媒介体的存在对研究cyt-c 的电化学反应会产生不利影响。 (3) cyt-c在促进剂修饰电极上的电化学反应 Hill小组2发现在4，4 一联吡啶存在下，cyt- c在金表面也能发生准可逆的 氧化还原反应。与媒介体不同，4，4一联吡啶在所研究的电位范围内不发生任 何电化学响应，故被称为cyt- c的电化学反应的促进剂。这一发现使细胞色素的 电化学研究得到了迅速发展，此后许多促进剂被相继发现。如董绍俊研究组4 系统地研究了细胞色素c 在多种氨基酸和多肽修饰电极上的电化学反应
6、，吴霞琴 研究了腺嘌呤的促进作用。此外，无机物、有机物、聚合物等对细胞色素c的电 化学反应也有促进作用。 (4) cyt-c在金属氧化物电极上的直接电化学反应 除了促进剂外，因金属氧化物表面具有含氧基团，其表面过剩电荷为负， 有利于带正电荷的cyt-c 在其电极表面的直接电子转移。Yeh和Kuwana 5首次报 道了cyt- c在掺杂氧化铟半导体电极上的直接电化学。循环伏安法和示差脉冲伏 安法实验结果表明，出计算的扩散系数外，cyt-c 在该电极上的所有电化学特征 均表明电极反应时准可逆的。 其他金属氧化物如氧化锡6、氧化铟7 、氧化钌8、氧化铱电极上9 ， cyt-c亦呈现准可逆的电子转移。
7、但是cyt-c在金属氧化物电极上的电化学行为， 除了与cyt-c的纯化有关外，还与电极表面的过剩电荷密度有关，电极表面过剩 电荷密度的符号和大小取决于溶液的pH值、特性离子吸附、掺杂含量、表面状 态和相对于平带电位(E fb)的电位。 1.3 cyt-c的电子传递模型 到目前为止，虽然人们对于cyt-c 在金属电极上的不可逆的电化学行为和在 促进剂修饰电极上能进行准可逆的电化学反应机理还不十分清楚，但已提出了 一些模型来解释上述的现象。 1.3.1 Hill快速洗脱附模型 Albery等人10 采用旋转圆盘、环盘技术研究了cyt-c在4，4一联吡啶修饰 金电极上的氧化还原反应特征，认为cyt-
8、c 在4，4一联吡啶修饰金电极上的反应 经历反应物和产物在电极表面的快速吸附和脱附过程。并运用促进剂“X-Y”结 构模型提出了cyt-c 在4，4 一联吡啶存在下的电化学反应机理。 1.3.2 Niki不可逆吸附模型 Niki等11 采用交流阻抗法、紫外可见反射法、红外反射法研究了儿种4-吡啶 基衍生物促进剂在cyt-c 传递中的作用，提出了至少存在的三种吸附类型: 第一种类型：cyt-c 的吸附能力强于促进剂，当二者共存于溶液中时，cyt-c 优先吸附于金属电极表面。如果将促进剂预先吸附于电极表面，在cyt-c的溶液 中会很容易被cyt-c 所取代。 第二种类型：cyt-c 的吸附能力与促进
9、剂相当，两者产生竞争吸附，故存在 两种吸附形式的cyt-c ，有的直接吸附于电极表面，而有的则吸附于电极表面的 促进剂分子上。因此，发生两种类型的氧化还原反应：一是共吸附于金电极上 的cyt-c ，一是吸附于促进剂上的cyt-c。由于共吸附cyt-c 与促进剂间的相互作用， 共吸附cyt-c在电极表面的变形程度远小于在裸电极上的变形程度。 第三种类型：促进剂的吸附能力强于cyt-c ，能强烈地吸附于电极表面，cyt- c吸附或键合于这些促进剂分子上，保持其自然形态并发生电子转移。 2 论文设想 如上所述，cyt-c 是一种结构简单，容易提取并在体内具有重要生理作用的 氧化还原蛋白质。研究其在生
10、物体内直接的电子转移并拓展其在分析化学上的 应用，仍是一个极富挑战而有意义的工作。在进行系统文献调研的基础之上， 我们选择了研究cyt-c 直接电化学行为和拓展其在分析化学上应用的研究目标， 进行了较系统的基础研究工作。首先，用PFV研究cyt-c在EPPGE上耦合的质子 传递。其次，分别用海藻酸钠和琼脂糖水凝胶将cyt-c 固定在电极表面，研究cyt- c的直接电化学行为，并研究hydrogel -cyt-c/EPPGE电极对O 2的还原作用，有可能 发展成为一种溶解氧的生物传感器。最后研究了cyt-c 在离子液体中的电化学行 为，对cyt- c在不同电极不同离子液体中进行了系统的研究总结，
11、并研究了其催 化性能。 1 H.Durliat, M.B.Barrau, M.Comtat, Bioelectronchem.Bioenerg., 1988, 19, 413 2 M.J.Eddowes, H.A.O.Hill, J.Chem.Comm., 1977, 771 3 S.C.Sun, D.E.Reed, J.K.Callison, L.H.Richard, F.M.Hawridge, Microchim.Acta, 1988, 3, 99 4 朱毅民, 硕士论文, 长春, 中国科学院长春应用化学研究所, 1989 5 P.Yeh, T. Kuwana, Chem.Lett. 97
12、7, 1145 6 E.F.Bowden, F.M.Hawkridge, H.N.Blount, J. Electroanal. Chem., 1984,161,355 7 T.Daido, T.Akaie, J.Electroanal.Chem., 1983,344,91 8 M.A.Harmer, H.A.O.Hill, J.Electroanal.Chem., 1985, 189,229 9 M.A.Harmer, H.A.O.Hill, J.Electroanal.Chem., 1984, 170,369 10 W J.Alberg, M.J.Eddowes, H.A.O.Hill, A.R.Hillamam, J.Am.Chem. Soc., 1981, 103, 3903 11 T.Sagare, K.Niwa, A.sone, C.Hinnen, K.Niki, Langumir, 1990, 6, 254
