1、生物制品无菌试验规程 生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的 本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无 菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试 验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。 1 抽样 1.1 原液及半成品 原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为 0.1%，但不得少于 1.0ml。 1.1.1 大罐稀释的制品抽样数量不得少于 10ml。 1.1.2 原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。 1.2 成品 每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的 前、中
2、、后样品）。 1.2.1 分装量在 100 支（瓶）或以下者抽检不少于 5 支，101500 支（瓶）者 抽检不少于 10 支（瓶），50110000 支（瓶）者抽检不少于 20 支（瓶， 10001 支（瓶）以上者抽检 40 支（瓶）。 1.2.2 每瓶装量 20ml 以上的冻干血液制品，每柜冻干 200 瓶以下者抽检 2 瓶， 200 瓶及以上者抽检 4 瓶。620ml 抽检量加倍。5ml 和 5ml 以下者按 1.2.1 项 抽检。 1.3 凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可 不再做。 2 无菌试验用培养基（培养基处方可附录 1） 2.1 检查制品中本菌是否
3、存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时 检查，有专门规定者除外）。 2.2 检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂 制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。 检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。 检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂 含量，做成斜面。 2.3 检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。 2.4 生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。 2.5 无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210 株）应达到 10-8， 短芽胞杆菌（7316 株）和生孢子梭状芽
4、胞杆菌（64941 株）应达到 10-7，白色 念珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉应达到 10-6。 2.6 生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏 度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏 度试验法见附录 2、3）。 2.7 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所 应定期抽检各所的无菌试验培养基。 3 无菌试验方法 3.1 无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行， 无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。 3.2 菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品
5、应用直接 接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的 制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接 接种法进行。 3.3 直接接种法 3.3.1 菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品 3.3.1.1 每安瓿装量 5.0ml 以上者（不含 5.0ml）取样不应少于 1.0ml，装量 在 5.0ml 以下者（含 5.0ml）取样不得少于 0.5ml，装量不足 0.5ml 者，全部吸 取。 3.3.1.2 含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者 至少为 1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为 1:50。先按 此比例
6、接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于 2025培育 34 天后移种至硫 乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各 2 管，每管 0.5ml。将 硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各 1 管置 3035培育，其余各管置 2025培育，培育时间除有专门规定者外共为 8 天。 3.3.1.3 不含防腐剂制品，装量在 5.0ml 以下者（包括 5.0ml）每 10 支安瓿 混合，装量在 5.0ml 以上者每 7 支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培 养基，分别置 2025、3035培育，培育时间共为 8 天。 3.3.1.4 支原体培养基临用时将半固体煮沸 1015 分钟后，冷却到 56左右，
7、加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比 为 7:2:1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀，等冷至 3537 时种入待检样品 0.51.0ml，共接种 2 支培养基，置 3537培育 14 天。 3.3.1.5 混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼 脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，34 天后移种。培养基种 类和支数、培育温度同 3.3.1.2 项，共培育 8 天后判定结果。 3.3.2 血液制品 3.3.2.1 取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。 样品每瓶装量不足 1.0ml 者，抽取全量，1
8、20ml 以下者（不含 20ml），抽取 1.0ml 以上，每支装量为 15ml 的培养基，接种 1.0ml。 样品每瓶装量以下者（不含）抽取 5.0ml 以上,100ml 及以上者按 15%抽样，每 支装量为 40ml 的培养基，接种 5.0ml。 应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培 养基支数之比为 2:1。 接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的 1/2 置 3035培育，其余置 2025培 育，改良马丁培养基置 2025培育，培育时间不少于 14 天。 3.4 薄膜过滤法 滤膜孔径为 0.220.3m。 取规定抽检样品数，每瓶装量 100ml 及 100ml
9、以下者取全量，100ml 以上者取 半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样品过 滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜 3 次，每次 100ml。过滤后， 无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基 2 支及改良马丁培养基 1 支（每支 装量不少于 40ml，高度不得低于 7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪 成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培 养基置 3035培育，其余各支培养基置 2025培育。培育时间不少于 7 天。 最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为 100ml。 3.5 检查厌氧性杂菌用培
10、养基需加热驱氧者，必须冷却到 45以下再行接种。 3.6 冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。 4 判定 4.1 无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。 4.2 无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂菌 生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第 一次复试量的 2 倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复试， 该批制品判为不合格。 4.3 成品无菌试验不合格的亚批数占整批的 30%以上时，由质量检定部门会同 有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。 附录 1 无菌试验培养基处方 1 硫乙醇酸盐培养基 胰酪蛋白胨
11、（或酪素胰酶消化液，以总氮计 2000mg） 15g 酵母浸出粉（或酵母透析液 200ml） 5g 葡萄糖 5g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐） 0.5g 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸 0.6ml） 0.5g 琼脂 0.650.75g 新鲜配制的 0.1%刃天青溶液（或 0.2%美蓝溶液 0.5ml） 1.0ml 去离子水（或蒸馏水） 加至 1000ml 最后 pH7.10.2 2 硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂） 胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计 2000mg） 15g 酵母浸出粉（或酵母透析液 200ml） 5g 葡萄糖 5g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）
12、 0.5g 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸 0.6ml） 0.5g 去离子水（或蒸馏水） 加至 1000ml 最后 pH7.10.2 3 改良马丁培养基 葡萄糖 20g 蛋白胨 5g 酵母浸出粉（或酵母透析液 100ml） 2g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁（含 7 分子结晶水） 0.5g 去离子水（或蒸馏水） 加至 1000ml 最后 pH6.40.2 4 猪胃消化液 半固体培养基 猪胃消化液 500ml 1:2 牛肉浸液 500ml 氯化钠 2.5g 葡萄糖 1g 琼脂 34g 牛心消化液 1000ml 酵母浸膏 1g 琼脂 34g 附录 2 需-厌氧菌无菌试验培养基灵敏 度试验法 1 菌种 1.1
13、需氧菌 乙型溶血性链球菌（32210 株），短芽胞杆菌（7316 株）。 1.2 厌氧菌 生孢子梭状芽胞杆菌（64941 株）。 以上菌株均由中国药品生物制品检定所分发。 2 培养基 凡应用于无菌试验的培养基（增菌和试验用）都应进行灵敏度试验。 3 操作 3.1 不应在同一无菌操作室内同时操作 2 个菌株。 3.2 将菌种接种于适宜的培养基，经 3035培育一定时间（乙型溶血性链 球菌和生孢子梭状芽胞杆菌培育 2448 小时，短芽胞杆菌培育 1820 小时） 后，将乙型溶血性链球菌和短芽胞杆菌分别刮入灭菌的生理盐水内制成均匀菌 液，生子孢梭状芽胞杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，再用灭菌生理盐水稀
14、释 适宜浓度制成均匀菌液，再将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度。然后用 0.1%蛋白胨水作 10 倍系列稀释。 3.3 将 10-610 -8（短芽胞杆菌、生子孢梭状芽胞杆菌为 10-610 -8，乙型溶 血性链球菌为 10-710 -9）菌液各 1ml 分别接种到 9ml（用于厌氧菌的培养基在 试管中装置高度不得低于 7cm）试验用培养基中，每个稀释度至少接种 3 管， 并用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生子孢梭状芽胞杆菌 的培养基，置 3035培育 3 天，接种短芽胞杆菌的培养基培育 5 天，记录结 果。 4 结果判定 以接种后培养基管数的 2/3 以上呈现生长的最高稀释度
15、为该培养基的灵敏度， 3 次试验中，以 2 次达到的最高灵敏度为判定标准。 附录 3 霉菌无菌试验培养基灵敏度试 验法 1 菌种 白色念珠菌、腊叶芽枝霉，由中国药品生物制品检定所分发。 2 培养基 凡应用于霉菌无菌试验用的培养基都应进行灵敏度试验。 3 操作 3.1 操作霉菌的无菌室应与其他无菌室隔离，有 2 个以上菌株试验时，不应在 同一无菌操作室内同时进行。 3.2 将菌接种在土豆培养基上，2025培养 57 天后用灭菌生理盐水洗下 菌苔，移入装有玻璃珠的大管中将孢子打散，经装有脱脂棉注射器过滤。将菌 液稀释至与标准比浊管相同之浓度，然后做 10 倍系列稀释。 3.3 将 10-510-7 菌液各 1ml 分别接种到 9ml 试验培养基中，每个稀释度至 少接种 3 管并用未接种过的培养基作对照，2025培育 5 天，逐日观察结果。 4 结果判定 以接种培养基管数的 2/3 以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3 次试验中以 2 次达到的最高灵敏度为判定标准。
