1、贵阳护理职业学院 2014 届高职高专学生毕业论文 Noggin、BMP2 和 IGF-I 对成骨细胞 生长的调节作用 系 别： 专 业： 指导老师： 学 生： 中国贵州贵阳 2013 年 6 月 论文编号： 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 II 目 录 中文摘要 .IV 英文摘要 .V 前 言 1 1. BMP 蛋白 2 1.1 BMP 结构和功能 2 1.2 BMP 诱导成骨机制 2 2. Noggin 基因的概况 .3 2.1 Noggin 基因的结构 .3 2.1.1 Noggin 基因结构特征 4 结 果 25 致 谢 51 参 考 文 献 52 2014 届贵阳护理职业学
2、院学生毕业论文 III 中文摘要 目的：研究 noggin、骨形态发生蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2） 、胰岛素样生长因子 I（insulin like growth factor I，IGF-I）对成骨细 胞增殖和分化的调节作用。 方法：1、将人成骨肉瘤细胞 MG63 于 RPMI 1640 培养基中培养，添加不同 浓度的 noggin、BMP2、IGF-I 蛋白进行药物干预，用四甲基偶氮唑盐 （methylthiazolyl-tetrazolium，MTT）法研究细胞的增殖率。2、选用最适浓度 的 noggin、BMP2、IGF-I 蛋白作用成
3、骨细胞，运用 ELISA 方法和 RT-PCR 技术 分别检测成骨细胞分化标志物骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase, BALP） 和骨钙蛋白（osteocalcin, OC）的蛋白含量和 mRNA 的表达情况。 结果：1、各药物干预组 OD 值与对照组相比有统计学差异（P0.05） ，对 成骨细胞增殖的作用效应呈剂量和时间依赖性，其作用的最佳时间均在 72h。 各药物组内之间比较，确定了最佳作用浓度，BMP2 为 210-9 mol/L，对 MG63 细胞的增殖率达 179.59；noggin 为 810-9mol/L，对其增殖的抑制率达到 15.51；IGF-I
4、 为 110-8mol/L，其增殖率达 189.80。 结论：BMP2、IGF-I 对 MG63 细胞增殖有促进作用，而 noggin 则抑制 MG63 细胞的增殖。Noggin、BMP2 和 IGF-I 促进 BALP 的分泌。Noggin 对 OC 蛋白的分泌有抑制作用，而 BMP2、IGF-I 则促进 OC 蛋白的分泌。 关键词：Noggin 蛋白，BMP2 蛋白，IGF-I 蛋白，成骨细胞，增值，分化 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 IV 英文摘要 Object: The aims is to study the effects of noggin, bone morphog
5、enetic protein 2 (BMP2) and insulin-like growth factor I (IGF-I) on the proliferation rates and differentiation of osteoblasts. Methods: The human osteosarcoma cell line MG63 were chosen using the RPMI1640 medium with 10 fetal bovine serum (FBS). Then, the cultured MG63 cells were exposed to BMP2, n
6、oggin and IGF-I at different concentrations with zero concentration as control group (CON). Ability of the proliferation of MG63 cells was detected by methylthiazolyltetrazolium method (MTT). the concentration of BALP and OC of osteoblasts were determined by ELISA method.at different time points (12
7、h, 24h, 48h, 72h) after optimal dosage of noggin BMP2, IGF-I were added into the culture medium.And the expression level of BALP and OC were investigated by reverse transcription PCR at the same time. Results: 1. The proliferation ability of MG63 cells treated with BMP2, noggin and IGF-I groups were
8、 significantly different compared with that of CON group(P0.05). The effects of three factors on MG63 cell was dose-dependently and time-dependently after cultured for 72h. The most effective growth of MG63 cells showed at 210-9 mol/L of BMP2 with the proliferation rate of 179.59 and 110- 8mol/L of
9、IGF-1 with the rate of 189.80, while 810-9mol/L noggin with the inhibitory proliferation rate of 15.51, respectively. 2. The concentration of BALP treated with BMP2, noggin and IGF-I groups were significantly different compared with that of CON group (P0.05) for 48h, especially, the noggin group was
10、 extremely significant (P0.01), and the BALP mRNA expression were also significantly different (P0.05). 3. The concentration of OC treated with noggin groups were significantly different compared with that of CON group (P0.01) for 24h, but the OC mRNA expression were not significantly different (P0.
11、05). The concentration of OC of BMP2 group were significantly different compared with that of CON group 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 V significantly different compared with that of CON group (P0.01) , and the OC mRNA expression were also significantly different (P0.05). The concentration of OC of IGF-I grou
12、p were significantly different compared with that of CON group significantly different compared with that of CON group (P0.01), and the OC mRNA expression were also significantly different (P0.05). Conclusion: BMP2 and IGF-I promoted the proliferation of MG63 cells whereas noggin inhibited. Noggin,
13、BMP2, and IGF-I enhanced the concentration of BALP in osteoblasts. BMP2 and IGF-I improved the concentration of OC in osteoblasts, whereas noggin inhibited. Key words: Noggin; bone morphogenetic protein 2 (BMP2); insulin-like growth factor I (IGF-I); MG63 cell; proliferation; differentiation. 前 言 生长
14、是动物个体发育特有的生理特点，其主要表现在体高体长的增长方面。 而体高体长的增长则源于骨骼的纵向生长，从而形成相应的骨骼系统，达到体 高体长的增长的目的。骨骼系统也是机体非常重要的一个组成部分，它支撑躯 体，保护内脏，并且和骨骼肌一起协调配合完成其运动功能。 在骨骼的生长发育过程中，骨组织不断进行着新骨形成和旧骨吸收的骨重 建过程，即骨形成（bone formation）与骨吸收（bone resorption）的动态平衡代 谢过程。骨形成由成骨细胞介导来完成。在骨形成过程中，成骨细胞主要经历 细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和细胞凋亡四个阶段。在幼年生 长时期，骨形成远远大于骨吸收（
15、Krupa B et al, 2005） ，为骨骼的生长提供了良 好的基础，也为体高体长的增长提供了重要的保证。在成年时期，骨的形成较 为稳定，骨骼的生长不再发生变化，这主要是受到骨形成与骨吸收相对均衡的 一个动态调节作用来完成。在晚年时期，则主要趋向于骨吸收大于骨形成，从 而骨形成会受到一定的影响，这将导致一系列骨疾病的发生，比如在老年人群 体中常出现的骨质疏松症。 然而骨骼的纵向生长是一种十分复杂的过程，是多种内分泌激素、生长因 子在时空上对生长板综合作用的结果。内分泌系统的全身性激素如生长激素、 降钙素、甲状旁腺激素、性激素、糖皮质激素等，与生长因子如胰岛素样生长 因子-（ Iinsul
16、in-like growthfactor-I，IGF-I） 、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs) 、转化生长因子 (transforming growth factor TGF)、成纤维细胞 生长因子(fibroblast growthfactors，FGF)、血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor，VEGF） 、甲状旁腺素相关肽（PTH-related peptide，PTHrP）等局部因子，以及外源性物质如维生素 D 等相结合，共同调 节骨骼生长过程。 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文
17、 7 1. BMP 蛋白(一级标题 ) 1.1 BMP 结构和功能（二级标题） 在 1965 年，Urist 首次发现骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP) ，BMP 属于转化生长因子 -(transforming growth factor-) 超家族的一员，具有 诱导骨形成的作用，现已发现其家族至少有 20 多个成员。 BMP 是一种低分子量酸性多肽，属于二硫健交联的生长和分化因子 （Wozney JM 等，1998） 。是结构类似的高度保守的功能蛋白质族，其 C-端有 一个高度保守的结构域，内含 7 个位置稳定的半肤氨酸，这对于形成正确的二 聚体结构有
18、重要意义。研究发现，BMP 的活性形式为二聚体，它既可以两个相 同的链形成的同源二聚体起作用，也可以两个不同的链形成的异源二聚体起作 用。BMP 合成时是一个大的前体蛋白，包括一个信号肤部分，一个前结构域及 一个羧基末端区。当羧基末端区经蛋白水解酶作用从前体蛋白上释放出来时， 二聚体即开始形成，它释放到细胞外与机体各处靶细胞表面的相应受体结合而 发挥作用。BMP 家族成员都通过结合两种丝氨酸/ 苏氨酸激酶跨膜受体（即 BMP型和型受体）发挥其生物学活性功能（ Miyazono K et al, 2001） 。研究 发现，BMP 之间可与不同的受体结合，表现信号传递的多样性。正是同一种 BMP
19、可结合几种不同的 型受体，所以才表现出具有调节细胞趋化、增生、分 化、迁移和凋亡等多种功能（Mehler MF et al, 1997） 。例如，BMP 与合适的受 体结合，能够在体内、体外诱导未分化的间充质细胞向软骨、骨细胞发生不可 逆的分化，形成软骨和骨组织（Barboza E et al, 1999） 。 1.2 BMP 诱导成骨机制（二级标题） BMPs 是由多组单位构成的复合物。据研究报道，能够对成骨前体细胞 MSCs 的成骨分化作用主要有 BMP2、6、9 三种 BMP 蛋白，而其它的 BMP 则 对成熟的成骨细胞的有作用，其中 BMP2 被认为是活性最强的唯一能单独诱导 成骨的因
20、子（Wozney JM et al, 1998） 。研究发现 BMP 作为一种强骨诱导活性的 生长因子，能够启动 MSCs 的成骨过程（Wu X et al, 1996） 。BMP 对 MSCs 分 化促进作用，主要是增加细胞内 BALP 活性，提高胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥 素的表达。这可能是因为 MSCs 中有较多的未分化细胞，BMP 与该细胞膜表面 特异的膜受体结合，通过信号转导途径，激活细胞相应基因表达促进成骨作用 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 8 的蛋白。Gazze 研究发现 BMP 降低细胞内的胶原酶 mRNA 的表达，利于细胞 外基质的合成（Gazzerro E et
21、al, 1999） 。跨膜丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶是 BMP 的 受体，BMP 的诱导机制控制着成骨过程的趋化、有丝分裂及分化三个关键步骤 （Reddi AH et al, 1995） 。 骨诱导是指一种组织或其产物能使第二种组织分化成骨的过程。诱导成骨 需具备三个条件（Stone CA 等，1997； Reddi AH 等，2000）：（l ）存在诱导 因子，当某些部位 BMP 浓度达到一定程度，就可以诱导骨生成。 （2）存在 BMP 的靶细胞群，即骨髓中存在诱导性成骨细胞（IOPC）和定向性成骨细胞 （DOPC） （Reddi AH et al, 1995） ，前者需要分子信号诱导分化，而后
22、者可以自 行分化为成骨细胞。诱导性成骨细胞是作为 BMP 靶细胞。体外研究表明 BMP 靶细胞还有：结缔组织中未分化而有活力的间充质细胞、骨膜基质细胞、骨膜 细胞（Bostrom MP et al, 1993；Bosch P et al, 2000） 。 （3）存在允许骨生长的正 常环境。 BMP 诱导成骨包含有 3 阶段，每一阶段都具有多分子放大效应（Reddi AH et al, 2000）：（1）诱导趋化，是指细胞响应化学信号分子浓度变化所做出的 方向性移行，在 BMP 趋化作用下，血浆纤维连接蛋白与产胶原的骨基质连接， 促进间充质细胞黏附其上发生增殖。天然牛 BMP3 和 BMP4 在
23、体外可以直接趋 化血中单核细胞（Reddi AH et al, 1995） 。趋化性与 BMP 浓度及细胞上的受体 密度有关；（2）诱导有丝分裂，细胞通过有丝分裂得到增殖；（3）诱导分化， BMP 可以诱导成纤维型细胞分化为成骨型细胞。BMP 在诱导软骨化骨时伴有 I 型胶原和 II 型胶原，碱性磷酸酶基因表达。 2. Noggin 基因的概况（一级标题） 2.1 Noggin 基因的结构（二级标题） 2.1.1 Noggin 基因的结构特征（三级标题） 在 1992 年，California 大学的 Harland，R.M.和 Smith，W.C.从非洲爪蟾的 胚胎中分离出 noggin 基
24、因，在人的体内定位于染色体 17q22，在大鼠与小鼠体 内定位于 11 号染色体。Noggin cDNA 编码产物为 26kD 的蛋白，具有疏水氨基 末端，是一种分泌蛋白。 Noggin 基因编码的蛋白序列具有高度的保守性，人类 noggin 的氨基酸序列 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 9 与爪蟾、小鼠、大鼠、兔子、马具有高度的同源性。它对胚胎和个体发育有着 重要的作用，如神经管的形成和关节软骨的形成。 结 果 实验采用 MTT 法主要基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT 分解， 产生紫兰色结晶状颗粒，其量与活细胞数呈正比，也与细胞的活力呈正比，因 此本文应用 MTT 法测
25、定 MG63 细胞增殖活性的变化。 运用外源 BMP2 蛋白干预 MG63 细胞的增殖，结果显示， BMP2 蛋白能够 直接促进 MG63 细胞的增殖，呈表现出剂量和时间依赖性，浓度为 210-9 mol/L 作用 72h 时增殖率最高，为 179.59。与本文的研究结果不同，其他学者 的研究结果（Kuo PL et al, 2006）显示，100ng/ml 的 BMP2 作用 48h 对 MG63 细胞没有增殖作用，显然本文使用的有效浓度更低。在体外，外源 BMP2 直接 刺激成骨细胞的形成和成熟，是成骨细胞增殖、分化和形成的有效促进物。研 究证实（王军琳等，2004） ，外源 BMP2 蛋
26、白能够显著诱导周期蛋白 CDK4 表 达的增加，促进细胞的增殖。因为细胞周期蛋白 D 在细胞 G1 期进程中控制着 G1 期的时间，CDK4 （或 CDK6）作为催化亚基与其结合形成复合物构成全酶 发挥作用，促使细胞越过限制点，完成 G1 期向 S 期时相的转换。成纤维细胞 中 cyclinD1 过度表达导致 G1 期缩短，提前进入 S 期，细胞体积小并丧失对外 源性增殖分裂信号的响应。Cyclin D1 和 CDK4 在肿瘤细胞的细胞周期循环中出 现障碍时，Cyclin D1 表达产物的堆积将使肿瘤细胞的 G1 期缩短，引起细胞的 过度增殖（Sherr CJ，1996） 。 外源性 nogg
27、in 蛋白对 MG63 细胞的增殖具有明显的抑制作用，并存在明显 的时间和浓度依赖性，浓度为 810-9mol/L 作用 72h 时对 MG63 细胞增殖的抑 制率达到 15.51。应用浓度为 1g/ml 时 noggin（康健等，2009） ，对 MG63 细 胞的抑制率为 15.30%，相比之下，本文应用的 noggin 有效浓度更低，之间的 差异可能与胎牛血清中的干扰因子有关。在培养基中添加胎牛血清的同时也将 其中的 BMPs 等因子带入（马忠仁等，2003；李巍等，2003） ，可能会对 noggin 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 10 蛋白的作用造成一定的干扰。noggi
28、n 对细胞增殖的抑制作用，主要通过抑制 BMPs 实现的。 Noggin 是 BMPs 的特异性拮抗剂，可与 BMPs 结合形成较大的 戒指样结构，遮蔽了 BMPs 上的受体结合位点，从而抑制 BMPs 与其受体结合 （Zehentner BK et al, 2002） 。在动物骨的形成过程中，noggin 主要拮抗 BMP2 的作用，本文的研究结果也显示，BMP2 对成骨细胞的增殖起直接的促进作用， 本文在加入 noggin 因子之前，以无血清的牛血清白蛋白代替胎牛血清对 MG63 细胞进行饥饿培养，消除了胎牛血清带入 BMPs 等干扰因子的影响。 本文的研究结果显示，外源 IGF-I 蛋白
29、对 MG63 细胞增殖有直接的促进作 用，且存在浓度和时间依赖性。IGF-I 在 110-8mol/L 作用 72h 时的增值率最高， 为 189.80，与已知结果基本一致（Langdahl BL et al, 1998）,IGF-I 刺激成骨细 胞的 DNA 和 RNA 的合成，促进细胞的生长、增殖及分化，以自分泌和旁分泌 的形式调节骨骼细胞的功能，影响骨的形成，并抑制小鼠成骨细胞的凋亡（Hill PA et al, 1997） 。与相同浓度的 BMP2 相比，IGF-I 的作用较强，提示成骨细胞 的增殖主要受 IGF-I 的调节。 骨骼纵向生长过程是以生长板为中心的骨形成与骨吸收的动态平衡
30、过程。 在机体的生长发育过程中，骨形成大于骨吸收，因此新骨不断形成，骨干加长， 从而实现骨骼的纵向生长。成骨细胞介导骨的形成。骨碱性磷酸酶（BALP）和 骨钙蛋白（OC）是成骨细胞在不同分化阶段的代谢产物。 骨组织形成经过两个步骤，首先是形成类骨质（osteoid） ，然后类骨质矿化 （mineralization）为骨组织。成骨细胞分泌骨基质的多种有机成分，包括骨碱 性磷酸酶、I 型胶原蛋白、蛋白多糖、骨钙蛋白等构成类骨质。胶原蛋白与粘多 糖构建骨盐沉积的支架。成骨细胞向类骨质中释放富含碱性磷酸酶和钙结合蛋 白的基质小泡。在碱性磷酸酶作用下，类骨质矿化成为骨基质。类骨质矿化是 无机盐有次序地
31、沉积于类骨质的过程，其中最关键的是无定形的磷酸钙形成羟 基磷酸灰石结晶。钙离子和磷离子是矿化的基本物质，钙离子和磷离子形成羟 基磷酸灰石结晶。骨钙蛋白（OC）具有钙离子结合位点，通过骨钙蛋白的钙离 子结合位点将羟磷灰石吸附沉积到胶原蛋白和粘多糖构成的骨架上，从而完成 矿化过程，有机物和无机物紧密结合起来，使骨骼得到生长。 本文对 BALP 蛋白含量和 mRNA 表达水平的研究结果表明，从 BALP 蛋白 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 11 含量水平看，在作用 48h 时，noggin 蛋白、BMP 蛋白和 IGF-I 蛋白对能显著增 加成骨细胞培养液中 BALP 的蛋白含量（P0.
32、05） ，noggin 蛋白的作用最强 （P0.01） 。BALP 的显著增加，导致类骨质矿化成为骨基质的作用得到加强， 为其骨组织的形成做准备。运用 RT-PCR 检测各实验组中 BALP mRNA 的相对 表达量，结果显示，在 48h 时，noggin 蛋白、BMP2 蛋白和 IGF-I 蛋白增加 BALP mRNA 的表达量（ P0.01） 。这些结果提示，成骨细胞 BALP 蛋白含量 主要受 BALP 基因表达水平的调控。 骨钙蛋白（OC）是成骨细胞在分化过程中释放的非胶原蛋白，是骨质钙化、 矿化必需的因子，是骨细胞分化终末阶段出现的标志。从 24h 开始，noggin 组 成骨细胞培
33、养液中 OC 蛋白的含量较对照组低（P0.01） ，对 OC mRNA 表达 的影响则不大（P0.05） ，说明 noggin 对 OC 蛋白水平的影响， noggin 可能主 要抑制 OC 蛋白的释放，对其基因的表达影响不大。 BMP2 能极显著地增加细 胞培养液中 OC 蛋白的含量（P0.01） ，同时，也能促进 OC mRNA 的表达， 提示 BMP2 对 OC 蛋白的合成和释放都有促进作用。IGF-I 作用于成骨细胞后， 其 OC 蛋白水平上升（P0.01） ，但抑制 OC mRNA 的水平（P0.05） ，其原 因有待进一步分析。 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 12 致
34、谢 光阴荏苒，岁月如梭。不知不觉三个春秋已匆匆而过，时值本文完成之际， 回首贵大数载，收益良多，感慨万千，因为在我的生命中有那么多可亲可敬可 爱的人值得感激。 作者： 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 13 参 考 文 献 1 马忠仁，冯玉萍，李倬，乔自林，侯兰新，李明生，冯若飞动物血清在 细胞培养中的重要性及其质量控制标准J西北民族大学学报（自然科学 版） ，2003，24（3）：56-59 2 王军林，刘源，金岩RhBMP-2 对舌癌细胞 Tca8113 增殖能力影响的研究 J实用口腔医学杂志，2004，20（2）：186-188. 3 李巍，李成仁，蔡文琴，姚忠祥胎牛血清对人胚胎
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40、6, 21(10): 1571-1580. 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 15 提示：论文中的表格要用三线表格 论文中表的格式如下： 表 3.1 各药物组对成骨细胞增殖功能的影响 Tab.3.1 The effect of noggin, BMP2, IGF-I on osteoblasts proliferation 时 间（h）组 别 浓 度 24 48 72 96 110-9 0.222 0.006 0.401 0.003 0.606 0.059 0.295 0.044 210-9 0.399 0.010 0.406 0.008 0.685 0.010 0.443 0.040
41、 BMP2 410-9 0.238 0.012 0.402 0.007 0.582 0.033 0.301 0.007 210-9 0.203 0.005 0.222 0.008 0.218 0.003 0.221 0.004 410-9 0.214 0.006 0.224 0.006 0.229 0.002 0.222 0.016 Noggin 810-9 0.191 0.004 0.212 0.005 0.207 0.005 0.231 0.006 110-9 0.313 0.029 0.551 0.014 0.617 0.005 0.312 0.015 110-8 0.521 0.002
42、 0.593 0.009 0.710 0.015 0.519 0.004 IGF-I 210-8 0.340 0.026 0.515 0.017 0.601 0.014 0.383 0.061 对照组 0.215 0.008 0.235 0.013 0.245 0.012 0.237 0.018 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 16 缩 略 词 英文缩写 英 文 全 称 中文全称 AMP ampicillin 氨苄青霉素 BMP2 bone morphogenetic protein 2 骨形成蛋白 2 bp base pair 碱基对 bFGF basic fibroblast g
43、rowth factor 碱性成纤维细胞发生因子 BALP bone alkaline phosphatase 骨碱性磷酸酶 BSA Bull serum albumin 牛血清白蛋白 cDNA complementary DNA 互补 DNA DEPC diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 EDTA ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 hBMSC human bone marrow mesenchymal stem
44、cells 人骨髓基质细胞 IGF- insulin-like growth factor- 胰岛素样生长因子- IGFBP insulin-like growth factor-binding protein 类胰岛素生长因子结合 蛋白 Kb kilo bases 千碱基 KDa kilo Daltons 千道尔顿 mol molar 摩尔 ml mililiter 毫升 mRNA messenger RNA 信使 RNA 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 17 MEM Minimum Essential Mdudm MEM 培养基 MOPS 3-N-morpholinopropanesulfonic acid 3-(N-吗啡啉) 乙磺酸 MTT methylthiazolyl-tetrazolium 四甲基偶氮唑盐 OC osteocalcin 骨钙蛋白 OD optical density 光密度 PBS phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 RNA ribonucleic acid 核糖核酸 SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 l microliter 微升 2014 届贵阳护理职业学院学生毕业论文 18
