1、临床免疫检验质量保证 卫生部临床检验中心 李金明 定 义 n 质量保证 (Quality Assurance,QA) 为一产品 或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的 有计划的和系统的措施 。 n 室内质量控制（ Internal Quality Control,IQC) 由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续 评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制 本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内 、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可 靠、可否发出报告的一项工作。 定 义 n 室间质量评价 （ External Quality Assessment, EQA ） 为客观
2、比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由 外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实 验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间 的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的 回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可 接受性。当 EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而 评价实验室操作时，常描述为实验室能力比对检验（ Proficiency testing, PT）。 在以前的文献中， EQA 常描述室间质量控制。 临床实验室常规检验步骤 n 标本收集： 选择测定项目、标本收集和保存 。 n 实验室测定： 标本接收、贴标签、样本处理 、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临 床诊疗
3、价值。 n 报告和解释： 结果发出、结果解释和临床管 理。 质量保证、室内质控和室间质评之间的关系 临床免疫检验方法 n 三大 “ 标记 ” 免疫检验技术 :荧光标记、放 射性核素标记和酶标 n 其它标记免疫测定技术：发光物标记、金 标、元素标记等 n 免疫沉淀和免疫凝集试验 酶联 免疫吸附试验 （ ELISA） 影响 ELISA测定的因素 n 试剂盒的因素 n 实验操作 影响 ELISA试剂盒质量的因素 n 固相材料 :聚苯乙烯塑料 n 抗原 :纯化、合成和基因工程抗原 n 抗体：多抗、单抗和基因工程抗体 n 酶结合物：酶免疫测定的核心成份 n 色原底物： OPD和 TMB n 运输贮存 酶
4、免疫测定操作中的注意事项 n 标本的收集、运送和保存 n 试剂准备 n 加样 n 温育 n 洗板 n 显色 n 比色 n 结果判断 n 结果报告及解释 标本的收集 n最常用的标本：血液，包括血清、 血浆和全血。唾液或尿液 。 n建议采用真空采血管及蝶形针具， 以免直接接触血液。 n标本采集时间、方式、采集量、采 集容器、预处理 标本的保存 n用于抗体检测的血清或血浆样品应 存放于 -20 以下， 短期（ 1周） 内进行检测的样品可存放于 2-8 。 试剂准备 n 从冰箱中取出的试剂，待温度与室温 平衡后使用； n 所用蒸馏水或去离子水应保证质量。 加 样 n避免加在孔壁上部，不可溅出和产 生气
5、泡。 温 育 n 常采用的温育温度有 43 、 37 、室温和 4 等。 n 温育所需时间与温度成反比，即温育温度 高，则所需时间相对较短。 n 温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面） 或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与温 室平衡。 洗 板 n每次温育后洗板是否彻底，与 非特异背景显色有很大关系。 显 色 n加入底物 A和 B后，应振荡混匀 n当底物为 OPD时，显色反应应避光 进行 比 色 n 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 n 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 n 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定 ，所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显 色具最大光吸收）如 4
6、50 nm和非敏感波长（所测 得的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等 所致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测 得的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。 结 果 判 断 n 按照试剂盒确定的 Cut-off值判断结果 n ELISA测定的 “ 灰区 ” （可疑结果的 含义） 定性酶免疫测定的 CUT-OFF值 临床免疫检验中存在的问题 n临床免疫检验的标准化问题 n临床免疫检验的室内质控问题 n临床免疫检验项目的滥用问题 临床免疫检验的标准化问题 n 临床免疫检验标准化的一般原则 （ 1）标准品和质控品 （ 2）参考方法 标准品和质控品（ 1） n 可提供标准品的国际标准化组织有： WH
7、O生 物学标准化专家委员会（ ECBS）、 英国国 家生物学标准和质控物研究所 (National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)、 美国 CDC和 CAP、 国 家卫生研究所（ NIH）、 IFCC等；国内有中 国药品生物制品检定所、卫生部临床检验 中心 标准品和质控品（ 2） n 在美国免疫检验试剂方法用于临床必 须有 FDA批准；在德国监督机构为 INSTAND； 在国内试剂批准文号由 SFDA 负责。 n 仅使用标准品并不能保证免疫测定结 果的可比性，但其在保证免疫测定质 量中的重要性却是不可替代的。 标准品和
8、质控品（ 3） n 标准品和质控品的功能 :可用作临床检测的 校准物 ; 可用来评价试验的有效性 ;作为室 内质控样本 ; 作为室间质评样本 . n 标准品分级 :可分为第一 ,第二和第三等三 个等级 . 一级标准数量有限 ,可使用 10-20 年 ,是冻干品 ,内含载体蛋白 . 一级标准可 用来校准第二和第三级标准 . 国际标准品 (IS)中作为第一级标准 , 二级标准可用来 维持校准 . 标准品和质控品（ 4） 对适用于免疫测定的标准品的一般要求 要 求 一级标准 二 级 标准 三 级 标准 来 源 单 一 多 个 多 个 使用时间 10-20年 1-5年 1-数年 制 备 纯化物于 载体
9、蛋 白缓冲溶液中 纯化 物 ,混合血清 , 提取物于载体蛋白 缓冲溶液中 血清或血浆 ,人工蛋白 为基础的缓冲液 定值方法 多 中心合作研究 免疫测定 ,与一 级标准比对 免 免疫测定 ,与二 级标准比对 贮存方式 冻 干 -70 下冻存 冰冻或于稳定溶液中 ,可能的话冻干 标准品和质控品（ 5） n 对用于不同类型免疫测定的一级标准的特殊要求 要 求 已知结构的多肽 (激 素和肿瘤标志物 ) 未知结构的蛋 白（抗体确定 的肿瘤标志物 ） 血清蛋白 低分子量化 合物（类固 醇、甲状腺 素） 纯 度 最纯的蛋白 部分纯化或未 纯化提取物或 体液 混合血清 化学纯（ 99% ） 定值方法 氨基酸分
10、析（物质浓 度）； 称重（质量浓度）； 比对较早的标准进行 免疫测定（ IU）； （ 生物测定， IU） 国际组织的一致 性结果； 研制者指定的单 位。 国际组织的一 致性结果； 比对纯蛋白进 行免疫测定（ 质量浓度） 称重（物质和 质量浓度）； 光电比色测定 。 标准品和质控品（ 6） n 标准品的单位 : 国际标准品一般以 IU/L 表示 ,但已很明确的物质如类固醇和甲状腺 素 ,则以摩尔浓度（ mol/L） 表示。鉴定明 确的肿瘤标志物的浓度常以质量浓度（ g/L ） 表示，而不太明确的标志物则以指定的 单位（ U/L） 表示。 标准品和质控品（ 7） n免疫测定并不能测定生物活性，其
11、实际上测定的是抗原上一个决定基 （ epitope） 或一组决定基的摩尔 浓度，尤其是使用单克隆抗体进行 测定时。因此，摩尔浓度（ mol/L ） 最能确切地反映所测定的是什么 。 标准品和质控品（ 8） : 一级标准的值传 递至校准物的几个校准步骤 标准品定值的测定方法 :参考方法 n 决定性方法（ Definitive method） : 是一个具 有高精密度及没有系统偏差的参考方法。 n 参考方法 :(Reference method） :应有低测下限、 不受非特异干扰及不与相关的化合物发生交叉反 应，同时还应该容易得到。 n 为保持参考方法的有效性 , 有必要建立一个参考 实验室的网络
12、 . 免疫测定标准化的难点 n基质效应（ Matrix effects） n抗原的不均一性和交叉反应性 n实验设计 临床免疫检验的室内质控问题 n 临床免疫检验室内质控不太受重视的原因有三 : 一方面可能是质控品来源有限或价格因素；其次 是尚没有意识到；再有就是不知从何做起。 n 使用统一合格的校准品开展室内质控才是解决各 实验室结果可比性差同时也是保证检验质量的唯 一有效的途径 。 n 室内质控的内涵并不仅仅是使用质控物进行统计 学质控，它包括分析前、分析中和分析后的质量 控制三个方面。 n 免疫检验室内质控既有与临床生化室内质控 共性 的一面，也有其 特性 的地方 室内质量控制（ IQC）
13、 nIQC主要包括三个方面： （ 1）测定前的质量控制； （ 2）统计学质量控制； （ 3）质量控制的评价 。 统计质控方法 n 基线测定 n 质控规则的表达方式及定义 n Levey-Jennings质控图方法 n Levey-Jennings质控图结合 Westgard多规 则质控方法 n 累积和 (CUSUM) 质控方法 n “ 即刻法 ” 质控方法 Levey-Jennings质控图 基本的统计学含义 n 稳定条件下，在 20个 IQC结果中不应有多于 1个结果超过 2SD（ 95.5%可信限） 限度；在 1000个测定结果中超过 3SD（ 99.7%可信限 ） 的结果不多于 3个。
14、n 如以 3 s为失控限，假失控的概率为 0.3% 。 “ 即刻法 ” 质控方法 n “ 即刻法 ” 质控方法的实质是一 种统计学方法 ,即 Grubs异常值 取舍法 ； n只要有 3个以上的数据即可决定 是否有异常值的存在。 IQC的局限性 n 在免疫测定中 IQC可能测不出的误差 n 测定前 测定中 测定后 样本鉴定不对 样本吸取不对 结果记录错误 样本贮存中变质 试剂加入不对 n 此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一 般要求小于 0.1%，且应均衡地分布于测定前、 测定中和测定后的不同阶段。 室间 质量评价（ EQA） n EQA n Proficiency testing (PT) 临床免疫检验项目的滥用问题 n 滥用问题 : 检验科的责任 ? n 比较严重的有以下二个方面 : 一是传染性病原体感染血清学标志物 ; 二是肿瘤标志物。
