1、1 酒精发酵大实验 实验目的：1 通过酒精发酵的实验，了解酒精生产的工艺过程；2 加深温度、溶氧、 pH 等发酵因素对酒精产量的影响，进一步明白发酵参数对发酵的重要影响； 3 发酵工艺的 控制的参数来自于多次实验后的优化。 实验内容：通过四组不同工艺参数的设计，发酵所得酒精的收率的差异以及相关指标 的检测，总结出酒精发酵的最佳工艺参数，并进行总结讨论。 第一部分 酒精生产的基本流程 一 糖化醪的制备 (一)原料的选择 凡是淀粉原料均可以用来生产酒精，考虑原料成本，生产上多用薯类为原料，其中以 木薯淀粉含量高，产量也很高。其次是谷类原料，以用玉米原料居多。本实验采用玉米为 实验材料。 (二)原料
2、的蒸煮 目的：1 在原料吸水后借助于高温高压的作用，使原料的淀粉细胞膜和植物组织破裂， 亦即破坏原料中淀粉颗粒的外皮，使其内容物流出，呈溶解状态变成可溶性淀粉，这一过 程叫糊化，原料经糊化后，再通过糖化剂作用即可变成可发酵性糖，为酒精发酵所利用。2 借助于高温高压的作用，把存在于原料中的大量微生物进行灭菌，以保证发酵过程不受原 料中的杂菌污染，正常进行酒精发酵。 步骤一 淀粉原料的膨化与预煮 淀粉是亲水性胶体，吸水后能发生膨化现象，工艺上称为淀粉的膨化。产生膨化现象 的原因是由于水分子渗入到淀粉颗粒的内部，使淀粉的巨大分子链扩张，因而体积增大， 粘度增加。 步骤二 淀粉的糊化（蒸煮） 已经预煮
3、好的淀粉料浆进入蒸煮锅后，在高温高压下，植物组织和细胞壁破裂，使淀 粉完全释放出来，称之为糊化。糊化后的料浆称为糊化醪，又叫蒸煮醪。 (三)蒸煮醪的冷却 冷却的目的是为糖化酶提供酶解的合适温度。蒸煮醪冷却到 60后很粘稠，低于 55 时，则变成凝胶体，不能与糖化剂混合。如果长时间缓慢冷却，则重新形成结晶体，此现 象称之为“蒸煮醪老化”以至在糖化过程中，不再受糖化酶作用。为此，应急速冷却至 62左右，并立即与糖化剂作用，以保证糖化醪的质量。 (四)淀粉的糖化 淀粉原料经过高温高压蒸煮后，淀粉糊化成溶解状态，必须在冷却后的蒸煮醪中加入 一定量的糖化剂，利用糖化剂中的淀粉酶使溶解状态的淀粉转化成能被
4、酵母菌利用的可发 酵性糖，这一由淀粉转化为可发酵性糖的过程，叫做“糖化” 。糖化后的蒸煮醪称为糖化醪。 (五)糖化醪的冷却 冷却到 26-28后，立即使用。 二 酒母的制备 (一) 传统酒母的制备方法 1 酒母用糖化醪的准备 同糖化醪的制备略作改变，料水比 1：5；加糖化酶量为生产用糖化量的 1.5 倍，糖化 2 时间 2-3h，糖化结束后，调 pH4.5-5.5 后（0.05-0.1%的硫酸溶液） ，升温至 85-90，消 毒 15-30 分钟。冷却至 27-30。 操作：在糖化过程中，用稀碘液检查糖化的程度（蓝色：30 个以上的葡萄糖链；紫色： 30-20 个葡萄糖的链；红色：20-13
5、葡萄糖的链；无色：7 个以下的葡萄糖链） 。 检测：要求还原糖的含量达 8%以上。 注意：由于是分批实验，酒母用糖化醪制备好后，应当分装备用。 2 酒母的培养 在制备好的酒母用糖化醪中接种活性干酵母，加入量为每 ml 糖化醪 100 万（每克活性 干酵母约 140 亿酵母） 。28 正负 1，摇瓶培养 8-12h。 指标： （1）酒母耗糖率：35-40%为宜。 耗糖率=（接种前糖度-成熟时糖度）/接种前糖度100 （2）酵母数：0.8-1 亿/ml（血球计数法计数） 。 （3）出芽率：20-30%（镜检视野下计算） 。 （4）死亡率：1%以下（美蓝染色） 。 （5）酒精度：3-4%（蒸馏测定）
6、 。 (二) 目前制作酒母的方法 称取活性酒精干酵母，按干酵母与活化液（葡萄糖液浓度 3%，蛋白胨 1%）1:25 的比 例将其复水活化，复水条件为水温度 35，复水时间 15 分钟，然后在 30活化 1 小时后 即为发酵用酒母。 （每班 250ml 活化液） 三 酒精发酵 (一)前发酵 酵母菌利用培养基中的溶解氧以及培养基成分繁殖，增加个体数量，同时产生少量酒精 分。酵母菌的用量一般为原料量的0.1-0.15%的普通活性干酵母(优质活性干酵母，细胞含 量超过200亿cfu/g，含水量小于6%的活性干酵母被称为高活性干酵母。普通的130亿cfu/g)。糖 化醪的温度26-28。前发酵温度低于3
7、0，发酵时间约10h。 (二)主发酵 酵母细胞数已达 1 亿左右/ml。这时，醪液中的溶解氧基本消耗完毕，酵母便以无氧酵 解的形式，将糖分转化为酒精和二氧化碳。这个阶段，酵母菌发酵产生大量的热量，应控 制温度 32-34，发酵时间约 12h。 (三)后发酵 残存的淀粉和糊精继续被糖化剂糖化生成葡萄糖，但量少并非常缓慢。控制温度 30- 32，约 40h。 整个发酵约 60-72h。 (四) 放罐蒸馏 (五) 生产核算 计算淀粉出酒率。 原料利用率=酒精总量原料重量 注：酒精总量按96%（v/v）计。 第二部分 发酵条件的优化 3 (一)实验内容：酵母浓度、温度、pH 值、溶解氧浓度对酒精发酵的
8、影响。 (二)材料与方法 1 实验材料 菌种，安琪耐高温酒精活性干酵母 市售玉米粉 糖化酶、菲林氏液、10%NaOH、10%HCL 、稀碘液、培养箱，摇床，蒸馏装置、抽滤装 置、真空泵、pH 精密试纸(pH3 左右的和 pH8 左右的) 、250ml 量筒、500ml 量杯、可调电 炉、酒精计、温度计、糖度计，250 ml 三角瓶、500ml 三角瓶，水浴锅，电炉，玻棒（可 用竹筷等代替）、250ml 容量瓶、电炒锅、棉花、天平、大铝锅 等。 2 实验方法 基本操作流程 (1) 糖化醪的制备 A 膨化阶段预煮 称取 4000g 玉米粉，按照 1：5 的比例加入 40的热水 (先以 0.5MH2
9、SO4将水调 pH 至糖 化时的要求 4.0-4.5，并在蒸煮锅内预热到 40后，停止加热)（实际生产料水比为 1：2.5-3.0） ，搅拌并维持 20 分钟，使淀粉充分吸胀（吸水阶段） 。随后，升温至 70-75， 搅拌并维持 20 分钟。 B 糊化阶段-蒸煮醪 在 70-75维持 20min 后，加热至沸腾并搅拌维持 10 分钟。 C 冷却 将蒸煮醪冷却至 62为冷却醪(在蒸煮锅内自冷却)。 D 液化糖化糖化醪 煮醪冷却至 62后，加入糖化酶，边搅拌边糖化。糖化时间 40 分钟，温度不低于 58 (点动加热维持)。控制糖化率控制在 47-56%。为加快糖化进程，加大糖化酶使用量到 2000
10、0IU/克玉米粉。 注：糖化完全约需 56h，糖化分前糖化和后糖化两个阶段。 E 糖化醪的冷却 将糖化醪在蒸煮锅内搅拌冷却至 26-28。 F 发酵 将冷却后的糖化醪先用 1M 的氢氧化钠调至 pH4.5-5.5，按照下述设计方案进行，优选发 酵方案。 3 工艺参数的优化 3.1 酵母浓度对发酵的影响（第 1 大组） 实验设计 1 (正常)（0.8-1.0 亿个/ml） ；2 ( 过量). 2-2.5 亿个/ml ；3 (不足). 0.3-0.5 亿个 /ml。 仪器：培养箱。 实验小组： 第 1 小组（正常组） ，正常工艺操作下的实验（温度 28、酸度 pH 值 4.5-5.5） 。取 1
11、个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液（充满系数 75%） ，加入复水活化后的酵母 菌 20ml，混匀后，发酵 72h 后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。 第 2 小组（酵母数加倍组） ，在接种酵母后，正常工艺操作下的实验（温度 25、酸 度 pH 值 5.0-5.3糖化后不再调整） 。取 1 个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液 （充满系数 75%） ，加入复水活化后的酵母菌 40ml，混匀后，发酵 72h 后，测量总体积、 4 酒精度得率及残糖率。 第 3 小组（酵母数减倍组） ，正常工艺操作下的实验（温度 25、酸度 pH 值 5.0-5.3 糖化
12、后不再调整） 。取 1 个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液（充满系数 75%） ， 加入复水活化后的酵母菌 10ml，混匀后，发酵 72h 后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。 3.2 不同温度对发酵的影响（第 2 大组） 实验设计：1 正常；2 高温 36；3 低温 20 仪器：三个摇床或培养箱，控制不同的发酵温度。 实验小组： 第 1 小组（正常组） ，用 3.1 之第 1 小组数据。 第 2 小组（高温组） ，取 1 个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液（充满系数 75%） ，加入复水活化后的酵母菌 20ml，混匀后，在 36高温下发酵 72h
13、后，测量总 体积、酒精度得率及残糖率。 第 3 小组（低温组） ，取 1 个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液（充满系数 75%） ，加入复水活化后的酵母菌 20ml，混匀后，在 20低温下发酵 72h 后，测量总 体积、酒精度得率及残糖率。 3.3 不同 pH 值对发酵的影响（第 3 大组） 实验设计：1 正常；2 pH8.0；3 pH3.0 仪器：三个摇床或培养箱，控制不同的发酵 pH。 实验小组： 第 1 小组（正常组） ，用 3.1 之第 1 小组数据。 第 2 小组（高碱性组） ，取 1 个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液（充满系 数 75%
14、）后，以 2N NaOH 调至 pH8.0，然后加入复水活化后的酵母菌 20ml，混匀后，在 正常温度下（28）发酵 72h 后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。 第 3 小组（高酸组） ，取 1 个发酵罐（1200ml 油膏缸）装入 900ml 糖化液（充满系数 75%）后，以 2N H2SO4调至 pH3.0，然后加入复水活化后的酵母菌 20ml，混匀后，在正常 温度下（28）发酵 72h 后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。 3.4 不同溶氧对发酵的影响（第 4 大组） 实验设计 1 正常；260rpm 摇瓶；3 120rpm 摇瓶 仪器：三个摇床或培养箱，控制不同的溶氧。 实验小组：
15、第 1 小组，用 3.1 之第 1 小组数据。 第 2 小组（高通气组） ，取 1 个发酵罐（500ml 三角瓶）装入 400ml 糖化液（充满系数 80%） ，加入复水活化后的酵母菌 10ml，混匀后，在 28、转速为 260rpm 下发酵 72h 后， 测量总体积、酒精度得率及残糖率。 第 3 小组（低通气组） ，取 1 个发酵罐（500ml 三角瓶）装入 400ml 糖化液（充满系数 80%） ，加入复水活化后的酵母菌 10ml，混匀后，在 28、转速为 120rpm 下发酵 72h 后， 测量总体积、酒精度得率及残糖率。 （三） 结果与分析（实验报告） 1 观察发酵过程中，发酵容器内酒
16、味大小、鼓泡大小随时间变化的情况并深入分析现象 与实验内容间的关系 2 比较发酵结束时原料出酒率并深入分析出酒率与实验内容间的关系。 3 残糖、残淀的测试并深入分析它们与实验内容间的关系。 5 第三部分 酒精发酵分析 一 原料中纯淀粉的测定 1 试样水解 准确称取试样 3-5 克，置入 250ml 的三角瓶中，加 100ml 水，于沸水浴中糊化 1h 。 冷却至 65，加 20ml 酶液，于 55-60之间保温糖化 2h。取出，加热煮沸 30 分钟，冷却 之 65，再加 20ml 酶液，于 55-60之间保温糖化至碘液指示剂不呈蓝色为止（实验方 法：将碘液指示剂盛于白瓷板空穴中，取一滴糖化液进
17、行试验） 。乘热用滤纸过滤，滤液用 250ml 容量瓶接收，用水充分洗涤残渣，冷却后用水定容至刻度。 吸取 100ml 滤液，置入 250ml 三角瓶中，加 11ml 20%盐酸溶液，于沸水浴中回流 1h。 取出，立即冷却，用 20%氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性，转入 250ml 容量瓶中，用水 定容至刻度，摇匀，为供试糖液。以糖度计测试。 另取 100ml 酶液，置入 250ml 三角瓶中，加 11ml 20%盐酸溶液，于沸水浴中回流 1h。 取出，立即冷却，用 20%氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性，转入 250ml 容量瓶中，用水 定容至刻度，摇匀，为空白液。以糖度计测试。 2 斐林试剂
18、的校正 吸取斐林试剂甲、乙液各 5ml，置入 250ml 三角瓶中，加 20ml 水，并从滴定管中加入 约 24ml 0.2% 标准葡萄糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗 0.2% 标准葡萄糖溶液在 1ml 以内） ，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸 2min。加 1 滴 1%次甲基蓝溶液，继续用 0.2%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在 1 分钟内完成。总耗糖量为 V ml。 3 定糖 吸取斐林试剂甲、乙液各 5ml，置入 250ml 三角瓶中，加 20ml 水，并从滴定管中预先 加入适量的水解糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗水解糖溶液在 1ml 以内） ，摇匀，于电 炉上加热至
19、沸，并保持微沸 2min。加 1 滴 1%次甲基蓝溶液，继续用水解糖溶液滴定至蓝色 消失，此滴定操作在 1min 中内完成。 4 计算 5 试剂 （1）酶液或粉剂 （2）稀碘液 称取 1.3 克碘，4 克碘化钾，置入研钵中，加少量水研磨至完全溶解，用水稀释至 100ml, 贮存于棕色瓶中。 （3）1%次甲基蓝 称取 1 克次甲基蓝，加 100ml 水 （4）0.2%标准葡萄糖溶液 准确称取 2 克无水葡萄糖（预先于 100-105烘干） ，用水溶解，加 5ml 浓盐酸，用水 定容至 1000ml。 （5）20%氢氧化钠溶液 称取 200 克氢氧化钠定容至 1000ml。 （6）20%盐酸溶液
20、量取 20ml 浓盐酸缓缓倒入 80ml 水中。 （7）斐林试剂 甲液：称取 69.3 克硫酸铜（CuSO 4.5H2O）,用水溶解并稀释至 1000ml，如有不容物， 可用滤纸过滤。 乙液：称取 346 克酒石酸钾钠，用水溶解并稀释至 1000ml。 （8）所需物品 6 100 ml 棕色滴瓶 2 个（稀碘液、1%次甲基蓝） ，1000ml 试剂瓶 5 个（20%盐酸、氢氧化 钠以及斐林试剂甲乙液、0.2%标准葡萄糖溶液） ，1000ml 容量瓶，5ml 移液管 2 支，250ml 三角瓶，50ml 量筒，托盘天平，烘箱，0.1%的分析天平，250-500ml 量筒，碱式滴定管、 荚、铁架台
21、、电炉，回流装置、循环冷却水引流装置、滤纸。 二 酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定 总糖的测定在糖化完成后进行，直接用酶解液按总淀粉的测定方法用 20%盐酸回流水 解，用斐林试剂滴定（参见原料中纯淀粉的测定） 。 酒母用糖化醪还原糖的测定是酒母制作过程中的重要工作，关系着酒母的质量。 1 原理 酒母用糖化醪还原糖的测定采用快速法。其反应与纯淀粉的测定相似，不同点为斐林 试剂甲液中硫酸铜量较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾 （黄血盐） ，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更明显。用糖度计测试。 2 试剂 （1）斐林试剂 甲液：称取 35 克硫酸铜（CuSO 4.
22、5H2O）, 0.05 克次甲基蓝，用水溶解并稀释至 1000ml，如有不容物，可用滤纸过滤。 乙液：称取 117 克酒石酸钾钠，126.4 克氢氧化钠，9.4 克亚铁氰化钾，用水溶解并稀 释至 1000ml。 （2）0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取 1 克无水葡萄糖（预先于 100-105烘干） ，用水溶解，加 5ml 浓盐酸，用水 定容至 1000ml。 3 测定步骤 （1）斐林试剂的标定 吸取斐林试剂甲、乙液各 5ml，置入 250ml 三角瓶中，加 10ml 水，并从滴定管中预先 加入约 20ml 0.1%标准葡萄糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗标准葡萄糖溶液在 1ml 以 内） ，摇
23、匀，于电炉上加热至沸，立即以 4-5 s 一滴的速度继续用 0.1%标准葡萄糖溶液滴 定至蓝色消失，此滴定操作在 1min 中内完成，总耗糖量 V0 ml。 （2）定糖 预备实验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5ml，置入 250ml 三角瓶中，加 V1 ml 试样稀释液 （含葡萄糖量约 5-15 mg）及适量的 0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸，立 即以 4-5 s 一滴的速度继续用 0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在 1min 中内完成，总耗糖量 V2 ml。 正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5ml，置入 250ml 三角瓶中，加 V1 ml 试样稀释液 和（V
24、2-1）ml 的 0.1%标准葡萄糖溶液，补加（V 0+10）-（V 1+ V2）ml 水，摇匀，以下同 标定操作，总耗糖量 V ml。 4 计算 还原糖（以葡萄糖计%）=（V 0-V）Cn1/ V 1100% 式中 V0-斐林试剂的标定值（ml） V-斐林试剂的测定值（ml ） C-标准葡萄糖溶液浓度（g/ml） n-试样稀释倍数 V1-所取试样稀释液体积（ml） 5 所需物品 7 1000ml 试剂瓶 3 个（斐林试剂甲乙液、0.1%标准葡萄糖溶液） ，1000ml 容量瓶，碱式滴 定管、荚、铁架台、电炉，5ml 移液管 2 支，250ml 三角瓶， 50ml 量筒，托盘天平，烘箱， 0.
25、1%的分析天平，250-500ml 量筒。 三 酒母质量的检测 1 细胞体积数量的检测（载玻片直接计数法） （1）摇动酒母液使其混合均匀，并用无菌水稀释到适当倍数，用无菌微量移液管取菌 液 0.01ml 于载玻片上，并用无菌接种环均匀地涂布在 1cm2的面积上。风干，固定，镜检。 （2）用物镜测微尺，测量显微镜观察时的视野直径，并以 S=r 2 公式，计算出视野 面积。 （3）不断变化视野，共观察 10 个视野，计数每一视野中的酵母个数。以下公式计算 每 ml 菌液中的含菌量。 原菌液菌数（个/.ml）= 1cm2/1 个视野的面积视野中的平均菌数100稀释倍数 2 出芽率及死亡率的检测 摇动
26、酒母液使其混合均匀，并用无菌水稀释到适当倍数，用无菌移液管或滴管取少量 酒母液于载玻片上，加 1 滴 0.05%美蓝溶液，盖片，镜检 10 个视野，求平均。 3 酒精含量的检测 取 100ml 酒母液于 500ml 蒸馏烧瓶中，加 100ml 自来水，接上冷凝器，缓火蒸馏，收 集流出液 100ml，用酒精计测量酒精度，并同时测量流出液的水温，查表可以得到酒精度。 四 发酵液的检测 1 残余发酵糖的检测 参见酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定中的还原糖的测定相关内容（可用糖度计测量后 代替） 。 2 残余淀粉的检测 参见酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定中的总糖的测定相关内容。 3 酒精度的检测 参见酒母质量的检测中酒精含量的检测方法（一份抽滤后的发酵液加等体积的自来水， 收集大约相等量的蒸馏液，一般取 100ml） 。 五 糖化率的测定 取蒸煮冷却后的蒸煮醪 15 克，加水 85ml，后面的操作参见原料中纯淀粉的测定相关 内容（可用原料淀粉含量计算后代替） 。 糖化后糖化醪还原糖的测定参见酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定中还原糖的测定相 关内容（可用糖度计测量后代替） 。 糖化率的计算公式： 糖化率%=（蒸煮醪总糖-糖化醪还原糖）/蒸煮醪总糖100
