1、1 酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气 条件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不 透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色 或粉红色，圆形 椭圆 卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%） ，分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵 母。 1.培养基： 1.1 葡萄糖 50g/L 尿素 1g/L （NH 4） 2SO41g/L KH2PO42.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟 加拉红 0.03g/L PH4.5-5.0
2、（富集用） 1.2 乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯 200g/L 葡萄糖（霉菌 用蔗糖）20g/L 乳酸 5ml 马铃薯去皮切片 200g，加水煮沸 30min， 纱布过滤，补足蒸馏水 1L，PH 自然。 （去掉乳酸可用于酵母菌和霉 菌培养用） （富集用） 1.3 麦芽汁培养基：1：4 水 60-65水浴 3-4 小时，4-6 层纱布过 滤，可加一个蛋清加水 20mL 调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15 波林，氯霉素 0.1g/L PH6.0-6.4 121 20min （分离保存用） 灭菌后加入 300u/ml 硫酸链霉素（集菌用） 2 1.4 虎红（孟加拉红）培养基：蛋白
3、胨 5.0g/L 葡萄糖 10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红 0.033g/L 氯霉素 0.1g/L 琼脂 15g/L PH 自然 （分离纯化用） 1.5 豆芽汁培养基： 黄豆芽 100g/L 葡萄糖 50g/L PH 自然。 100g 黄豆芽，加水煮沸 30min，纱布过滤，补足蒸馏水 1L 1.6 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖 30g/L 硝酸钠 3g/L 磷酸氢二钾 1g/L 氯化钾 0.5g/L 硫酸镁 0.5g/L 硫酸亚铁 0.01g/L 琼脂 15-20g/L 121 20min PH 自然 一般分离黄酒酵母 酒精酵母使用曲汁培养基
4、，啤酒酵母用酒花麦 汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般 不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌 悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵 力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的 酒精（13-17%） ，霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25- 28 2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵 母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成， 要配合镜检。 实例：将待分离的样品 10g（ml）放入 90ml 无菌水或生理盐水 /150ml 三角
5、瓶（玻璃珠） ，摇床振荡 20-30min，取上清液接种于酸 性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基 酸性麦芽汁或酸性豆芽汁） 3 25-28 2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至 三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色， 活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选： 分离：取集菌液适当稀释，吸取 0.1-0.2ml 梯度菌液（至少两个两 个平衡） ，涂布于马铃薯-葡萄糖 麦芽汁或虎红培养基平板，也可采 用混菌法或蘸取集菌菌液直接划线， （平放 12h 后倒置培养） ，25 培养 48h，低温酵母菌 15 高温酵母菌 35 40 45，形成清 晰菌落。在培养皿
6、底划分小方格，待菌落生长良好后，用放大镜或 低倍镜，观察每格内每个菌落编号并描述，颜色 表面 边缘 切面等， 再制片在高倍镜下观察各菌株的个体形态，做好记录。选择不同菌 落分别接于麦芽汁斜面，25培养 48 小时备用。 纯化：培养基与分离培养基相同，否则，不同培养基菌落会改变形 态，决不能认为菌落外观相同菌属于同一种。菌落外观相近的菌落， 只能挑取一至数个菌落为代表进行纯化。常用方法为平板划线分离 法：挑取单菌落于平板划线纯化菌株，25-28 2-3d，选择菌生长 快 菌落大 典型继续纯化，每个分离物至少经两次划线，结合镜检 保持菌株的纯度，对于保存菌株也应定期检查纯度。纯化的菌株转 接于麦芽
7、汁斜面 25-28 2d 待鉴定或用灭菌液体石蜡封面于 4冰 箱保存。 筛选：性能测定：根据不同需要，选择不同性能测定方法。 产气性能比较：采用杜氏管发酵法，将斜面菌种两环接种于麦芽汁 4 或豆芽汁液体培养基中（可以分两次加培养基） ，28振荡培养 48h，产气时间和产气量。 产酒精能力测定：采用蒸馏法测酒精含量。 产香能力测定：通过嗅觉鉴定。 附：不同酵母菌的形态特征： 酿酒酵母：在麦芽汁琼脂培养基上，菌落与细菌相似，比细菌大而 厚，不透明，表面光滑，湿润粘稠，乳白色，形成假菌丝。单细胞， 形状有圆形 椭圆形等，大小不一。在麦芽汁中，沉淀表面形成环状 膜。不能利用硝酸盐。 产朊假丝酵母：在麦
8、芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光 泽或无光泽，边缘整齐呈菌丝状。细胞呈圆形 椭圆形和圆柱形等。 能利用硝酸盐为氮源。 实例 1：大曲中酵母菌的分离及鉴定 1.富集培养：取 5g 样品，在试管中加入 10ml 麦芽汁培养基，同时 加入一滴乳酸摇匀，25-2824h，后取 1ml 菌液转入另 10ml 麦芽汁 培养基试管中培养 25-28 24h，稍长(过长则霉菌长出)。培养液 变浊产膜或沉淀。观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央 的 0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后 换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还 原，从而使菌体不着色，用此方
9、法可判断酵母菌的死活。 5 要求：较高的糖 50g/l， 抑菌剂 孟加拉红 0.03 g/L（许多细菌 放 线菌和快速生长的霉菌），PH 4.5。或用乳酸（5ml）-马铃薯 （200g）-葡萄糖（20g）培养基富集。 2.酵母菌分离：平板划线 涂布或混菌均可。取集菌菌液，梯度稀释， 取 10-5 10-6 10-7,0.1ml 菌液涂布虎红培养基上，25-28 48h（若 不纯可挑取单菌落连续多次划线） 。 3.酵母菌选择：对典型单菌落，经美兰染色，制片镜检，进行描述 性 记录，然后选择不同菌落转接于麦芽汁斜面，25-28 48h 备用。 4.酵母菌纯化：挑取 10-7 培养基不同的单菌落，在
10、 PDA 培养基接种 25-28 2-3d 后，取形态不同的单菌落传接二次，观察菌落形态确 定为单菌落后，分别接种于 PDA 培养基和 MA 培养基中，25-28 3d， 根据在不同培养基中菌落形态进行初步分类。将所得菌株于斜面培 养 保存在 4冰箱中。 实例 2：高温堆积糟醅中酵母菌的选育 1.集菌：同上 45 2-3d，依此法转接 2-3 次，再行分离。 2.分离：梯度菌液分别涂布于麦芽汁 麸皮汁 豆芽汁平板于 45 2-3d，将平皿上生长的菌落划线纯化，菌株移入斜面，备用。 6 3.有效菌株的确认：分离的数十株酵母经镜检有酵母属的各种酵母， 假丝酵母，红酵母，白地霉等。用高粱粉糖化液，饴
11、糖稀释液，麸 皮 等进行发酵，测定次生代谢产物，依次判出 Y1 Y2 Y3 Y4 等与酱香 酒 产量质量有关。 4.菌种的分类鉴定： 4.1 形态特征：（麦芽汁琼脂） 编号 形态特征 Y1 菌落由白色到奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。边缘呈波纹，凸起， 色黄，中心凹，奶油色，室温放一月后，培养物由奶油色变浅褐色。细胞呈圆 卵 圆 椭圆，大小不等。单个，成双，偶尔成短链，多边芽殖。 （意大利酵母） Y2 菌落呈浅奶油色，菌落平滑或部分有皱纹，无光泽，边缘呈黄色，大波纹状。 细胞圆形卵形 椭圆形，大小不等，多边芽殖。 (地生酵母) Y3 28 3d 后，细胞圆形 椭圆形，单个或成双，两端芽殖
12、，培养物奶油状， 奶油色到浅褐色，平滑，稍平坦，光亮，边缘偶尔波纹，无真菌丝。 （酿酒 酵母） Y4 菌落白色至奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。培养时间偏长菌落渐 硬，并呈菌丝状，不易挑起。在麦芽汁平皿上，菌落白色，凸起，有皱纹，边 缘波纹状。细胞较小，卵圆 椭圆形，有大量真菌丝。 （间型假丝酵 母） 4.2 生理生化特征 4.2.1 发酵糖类： 酵母菌发酵液成分分析 Y1 Y2 Y3 Y4 香 气 稍酱香，酯香 稍酱香，酯香 酯香 醇甜香 酒精（%） 3.9 3.9 4.3 5.1 代谢产物 乙 丙 丁 乳 异戊酸 同 Y1 除硫甲基丙醇 乙 丙 丁 乳酸 7 乙醛 乙酯 乳酯 丙醇
13、其他成分均有 乙醛丙醇异丁醇 异丁醇 异戊醇 戊醇 异戊醇 硫甲基丙醇 各种酵母发酵糖类结果 Y1 Y2 Y3 Y4 葡萄糖 + + + + D-半乳糖 + - + - 麦芽糖 + - + + 蔗糖 + - + + 乳糖 - - - + 棉子糖 - - + + 蜜二糖 纤维二糖 海藻糖 松三糖 菊糖 可溶性淀粉 -甲基-葡萄糖苷 同化碳源 葡萄糖 + + + + D-半乳糖 + - + - 麦芽糖 + - + + 蔗糖 + - + + 乳糖 + - - + 棉子糖 - - + + 蜜二糖 山梨糖 纤维二糖 海藻糖 松三糖 + 菊糖 - - 可溶性淀粉 -甲基-葡萄糖苷 + 卫茅醇 + 甘露醇 D-木糖 - - 琥玻酸 柠檬酸 各酵母菌其他生化生理特征 Y1 Y2 Y3 Y4 8 同化氮源（硝酸钾） 同化乙醇 液化明胶 产酸试验 产醋试验 结果： Y1 意大利酵母，Y2 地生酵母，Y3 酿酒酵母，Y4 间型假丝酵母 分离耐酸耐高温酵母菌选择压排底醅或双轮底糟为试样，集菌培养 基中加入少量底醅浸出液。
