1、报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调 控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产 物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行 定量测定。 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(oc
2、s) nos、ocs 这两个基因是致瘤土壤农杆菌 (Agrobacterium tumfaciens)的 Ti 质粒特有的，对 Ti 质粒进行改 造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中 均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。 新霉素磷酸转移酶基因(npt) 、氯霉素乙酰转移酶基因(cat) npt、cat 及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰 化等) ，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生 素的筛
3、选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉 素乙酰转移酶基因测时可通过放射自显影观察。 荧光素酶基因（luciferase Gene） 1985 年从北美荧火虫和叩头虫 cDNA 文库中出来的，该酶在有 ATP、Mg2、O2 和荧光素存在下发出 荧光，这样就可用植物整株或部分直接用 X-光片或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比 cat 基 因高 301000 倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。 -D-葡萄糖苷酶基因 该酶催化底物形成 -D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、 荧光等
4、进行检测。 除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。 在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。 绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架 长度约 740bp，编码 238 个氨基酸残基，其肽链内部第 65-67 位丝氨酸脱氢酪氨酸甘氨酸通过自身 环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜 或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。 此外还有 -半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。 荧光检测器是一种专用型
5、检测器，灵敏度在目前常用的 HPLC 检测器中最高，在 HPLC 中 应用较多。仅次于紫外吸收检测器。它用于能激发荧光的化合物。 工作原理是：用紫外光照射某些化合物时它们可受激发而发出荧光，测定发出的荧光能量 即可定量。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代 谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍 生剂后，可以检测很微量的氨基酸和肽。 肿瘤细胞株的传代培养 传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体 或二倍体低于 75，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植 的能力和
6、较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是：具恒定繁殖特性，少数细胞即有繁 殖能力，在琼脂内能形成克隆；有的为贴壁生长，有的悬浮生长。染色体组型为异倍体 ，大多数人源细胞染色体为 6070 条左右。保留种属特异性，但组织分化性与脏器特 性均消失。具致癌性。由于传代细胞繁殖迅速，易获取、易保存，已为各实验室广泛采 用。 1、HeLa 细胞的传代培养 试剂与仪器 HeLa 细胞。 Hanks 液，025胰蛋白酶，002EDTA，生长液，青、链霉素 (PS)，56 NaH CO3 小三角烧瓶，培养瓶，无菌吸液管(5m1 及 1m1)、毛滴管，废液瓶等。 方法与步骤 （1）选生长良好的 HeLa 细胞一瓶，
7、轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎 片，然后连同生长液一起倒出，用 Hanks 液洗一次。 （2）从无细胞面侧加入 0 25胰蛋白酶液或胰蛋白酶一 EDTA 消化液 45ml，翻转培 养瓶，使消化液浸没细胞 1min 左右。 （3）翻转培养瓶，放置 510min，为促进细胞的消化，可以加入 37预热的消化液，或 在细胞面向上时，用手掌贴着细胞面的瓶外壁，待肉眼观察细胞面出现布纹孔状为止。 （4）倒出消化液，如系 EDTA 消化，需沿细胞层的对面加 Hanks 液 45m1 洗涤，洗 涤时轻轻转动培养瓶，让液体在瓶内慢慢流动，以洗掉消化液；如系胰蛋白酶消化，倒掉 胰酶后可不洗涤。 （5
8、）沿细胞面加入适量新配制的生长液，洗下细胞，并用吸管吹打数次，使细胞分散开 ，按 1：2 或 1：3 分配传代培养。 （6）37培养，接种后 30min 左右可贴壁，48 小时可换生长液，一般 34 天可形成 单层，形成单层后再换维持液供试验用 二、培养方法 肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。 在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养 法均可。 （一）要点 1取材： 人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区 ，取材时尽量避免用退变组织，要挑选
9、活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材 后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于 4中，但不宜栽过 24 小时。 2培养基： 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A 等培养基 等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤 细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性 产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿 瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对
10、生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培 养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子如乳腺癌细胞等） 。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相 关生长因子培养更易成功。 3成纤维细胞的排除： 成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得 快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。 （二）成纤维细胞排除法 1机械刮除法： 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝） 、或裹少许脱脂棉制成，装入试管 中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除） 。刮除程序为： （1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面
11、圈下生长肿瘤细胞的部位； （2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间； （3）用 Hanks 液冲洗一两次，洗除被刮掉的 细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止 2反复贴壁法： 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细 胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。 （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗 2 次，加入不含血清的 培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为此 A、B、C 三个培养瓶；首先把悬液接种入 A
12、 培养瓶中。置温箱中静止培养 520 分 钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入 B 培养瓶中后；向 A 瓶中补 充少许完全培养液置温箱中继续培养； （4）培养 B 瓶中细胞 520 分钟后，接处理 A 的方法，把培养液注入 C 培养瓶中；再向 B 瓶中补加 完全培养基。 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见 A 瓶主要为成纤维细胞 ，B 瓶两类细胞相杂，C 瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌 细胞纯化为止。 3消化排除法： 此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是： （1）先是用 0.5%胰蛋白酶和 0.02EDTA（1
13、：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液 继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新 的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维 细胞除净。 4胶原酶消化法： 本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。 （1）可用 0.5mg/ml 的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后， 即终止消化； （2）用 Hanks 洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，
14、可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除 净，可再次重复。 5其它方法： 有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重 1.0251.085 的密度 梯度离心液，加入细胞悬液后，在 23中 800g 离心 10 分种。在比重 1.0251.050 层为成纤维细胞，在 比重 1.0501.085 层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如 SOD 抑制成纤维 细胞生长的方法。 选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。 （三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿
15、瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞 初代接种培养后，常出现以下几种情况： 完全无细胞游出或移动； 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代； 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡； 传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系 。 以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获 得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。 1适宜底物： 把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。 2生长因子： 应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促
16、细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促 生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。 为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，可采用动物体转嫁 接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。 3.动物体媒介培养方法： （1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用 Hanks 液洗净血污，切成 13 毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块 ，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块； （2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织； （3）进行体外培养。 （4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒
17、介接种，有活力的肿瘤细胞数量 增多，细胞培养易于成功。 肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。 （四）体外培养肿瘤细胞生物学检测 一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立 细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明： 所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。 阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。 【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细 胞骨架微丝微管的排列状态等。 【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。 【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。 【凝集试验】检测凝集力。 【软琼脂培养】检测集落形成能力。 【异体动物接种】向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。 【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。
