1、中国组织工程研究 第 17 卷 第 53 期 20131231 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.016 http:/www.crter.org 郑晓筠，罗倩欣，陈倩琪，熊喜峰，刘玉荣，马宁芳 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 J.中国组织工程研究， 2013， 17(53):9196-9202. P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 9
2、196 www.CRTER.org 郑晓筠，女，1990 年生， 广东省东莞市人，广州医 科大学临床学院在读学士， 主要从事肝硬化方面的研 究。 383271008 通讯作者：马宁芳，博士， 教授，广州医科大学基础 学院组织学与胚胎学教研 室，广东省广州市 510182 nfma . 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)53-09196-07 修回日期：2013-09-19 (201304019/GQ) Zheng Xiao-jun, Department of Histology and Embryology, School of Basic Sc
3、iences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China 383271008 Corresponding author: Ma Ning-fang, M.D., Professor, Department of Histology and Embryology, School of Basic Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China nfma Accepted:
4、2013-09-19 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 * 郑晓筠，罗倩欣，陈倩琪，熊喜峰，刘玉荣，马宁芳(广州医科大学基础学院组织学与胚胎学教研室，广 东省广州市 510182) 文章亮点： 1 肝硬化为肝脏不可逆病理改变，临床上多使用保守治疗以控制肝硬化进程。 2 文章的创新之处在于立足肝脏自身强大的再生能力，尝试用肝部分切除诱导残余肝内具再生能力的细 胞增殖以重建肝脏结构。结果显示，早期肝硬化部分切除可明显改善甚至逆转硬化肝的组织结构。 3 肝硬化部分切除后肝内有效增殖细胞数的相对减少及肝再生反应滞后等因素，是应用该方法治疗时临 床上不可忽视的重要环节，在实际应用中应根据肝功能代偿能力等
5、指标进行科学评估。 关键词： 器官移植；器官移植基础实验；肝硬化；四氯化碳；小鼠；Masson 染色；肝部分切除；肝再生；结蛋白； -平滑肌肌动蛋白；5-溴脱氧尿核苷；省级基金 主题词： 肝硬化；肝切除术；肝再生；结蛋白；肌动蛋白类 基金资助： 广东省 2011 年大学生创新实验项目(2011)* 摘要 背景：肝脏自身具有强大的再生能力，临床资料显示大部分肝癌患者合并有肝硬化，切除肿瘤后肝脏质量可 逐渐恢复，提示硬化的肝脏仍具备修复潜能。 目的：尝试用肝部分切除方法诱导小鼠硬化肝组织内具再生能力的细胞增殖，观察再生肝脏的结构变化。 方法：使用 CCl4 皮下注射方法制备小鼠肝硬化模型。对肝硬化
6、小鼠行肝部分切除，于切除后 1，3，5，7，10，14 及 21 d 取小鼠肝组织并称质量。观察比较肝部分切除后不同时间小鼠再生肝组织的结 构变化；评估肝再生率；免疫组化方法分析肝星形细胞标志分子结蛋白及肝星形细胞活化标志分子 -平滑 肌肌动蛋白的表达变化；5-溴脱氧尿核苷标记技术对增殖细胞进行定性、定位。 结果与结论：肝硬化小鼠肝部分切除后第 1，3 ，5，7，14，21 天肝再生率分别为 6.58%， 22.03%，21.39%，29.05%，45.22% ，50.98%。苏木精-伊红染色和 Masson 染色显示 CCl4 注射 8 周后呈早期肝硬化病理改变，肝部分切除后肝组织结构逐步改
7、善。免疫组化结果显示肝部分切除后第 1 天 再生肝组织内结蛋白表达减少，但第 3 天至第 14 天呈上升趋势，21 d 则明显减少；肝再生过程中各时间点 -平滑肌肌动蛋白表达依时递减。5-溴脱氧尿核苷阳性细胞在肝部分切除后 1-7 d 主要为肝细胞，肝部分切 除后 14-21 d 阳性细胞定位于肝血窦内皮及窦腔内。结果表明早期肝硬化小鼠大部肝切除后 3 d 出现明显的 再生反应，并逐步恢复正常的肝组织结构。 Regeneration and structural changes of mouse cirrhotic liver after partial hepatectomy Zheng X
8、iao-jun, Luo Qian-xin, Chen Qian-qi, Xiong Xi-feng, Liu Yu-rong, Ma Ning-fang (Department of Histology and Embryology, School of Basic Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Liver possesses a powerful regenerative capacity. It is rep
9、orted that the most patients suffering from hepatocelluler carcinoma are accompanied with liver cirrhosis. The liver weight can be gradually restored after tumor resection, which indicated a regenerative potential of cirrhosis liver. OBJECTIVE: To try to use partial hepatectomy to induce proliferati
10、on of cells with regeneration capacity in cirrhotic liver of mice, and to observe the structural changes of regenerated liver. METHODS: The liver cirrhosis model of mouse was produced by injecting CCl4 liquid subcutaneously. The mice with liver cirrhosis were subjected to partial hepatectomy. The re
11、sidual liver was dissected and weighted at 1, 3, 5, 7, 10, 14 and 21 days after partial hepatectomy. The structural changes of regenerating livers were compared after partial hepatectomy at various time points. Liver regeneration rate was evaluated. Immunohistochemical method was used to analyze des
12、min and alpha-smooth muscle actin expression in the hepatic satellite cells. The 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation labeling method was used to exhibit and localize the regenerating cells. RESULTS AND CONCLUSION: The liver regeneration rates of the mice with liver cirrhosis at the 1, 3, 5, 7, 14,
13、郑晓筠，等 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9197 www.CRTER.org 肝再生率=造模后取材时的肝质量 -(造模前总肝质量 - 切除肝质量)/造模前总肝质量100% 21 days after the partial hepatectomy were 6.58%, 22.03%, 21.39%, 29.05%, 45.22%, and 50.98% respectively. The results of hematoxylin-eosin staining as well as Masson
14、staining showed the pathological early cirrhosis features of the liver after CCl4 treatment for 8 weeks and the structure of residual livers improved gradually after partial hepatectomy. Immunohistochemical results demonstrated that the expression of desmin in regenerating liver was decreased at 1 d
15、ay after partial hepatectomy, but showed an uptrend from 3 to 14 days and decreased at 21 days. The expression of alpha-smooth muscle actin decreased gradually at every time point after partial hepatectomy. The 5-bromo-2- deoxyuridine-positive nucleus localized in hepatocytes at 1-7 days and mainly
16、localized in hepatic sinusoid endothelium and intracavity at 14-21 days after partial hepatectomy. The regenerative reaction of mouse cirrhotic liver appeared at 3 days after partial hepatectomy and the structure of normal regenerating liver will be improved and restored gradually. Subject headings:
17、 liver cirrhosis; partial hepatectomy; liver regeneration; desmin; actins Funding: the College Students Innovative Experimental Projects of Guangdong Province (2011)* Zheng XJ, Luo QX, Chen QQ, Xiong XF, Liu YR, Ma NF. Regeneration and structural changes of mouse cirrhotic liver after partial hepate
18、ctomy. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9196-9202. 0 引言 Introduction 肝硬化是由多种因素引发的肝脏不可逆病理改变， 临床上多使用保肝护肝等对症治疗来改善肝功能、延 缓肝硬化进程 1。晚期肝功能失代偿则选择肝移植，然 而肝供体极为有限，严重制约了晚期肝硬化的治疗， 因此，控制肝硬化进程、缓解甚至逆转肝病理变化是 临床治疗的目标 2。 肝硬化的严重结局可转化为肝癌，统计学资料显 示约85%的肝癌患者合并有肝硬化 3-4，临床首选手术 切除，大多数患者术后可逐步恢复肝脏功能 5-6，说明 硬化的肝脏仍保留有一
19、定的修复潜能，因此立足肝脏 的再生能力，用肝部分切除方法诱导残余肝内具再生 能力的细胞增殖、修复肝脏的结构及功能，不失为治 疗早期肝硬化的又一种选择。然而肝硬化状态下实施 部分切除，其所诱导的肝再生状况、再生肝组织结构 正常与否目前未见报道。 文章应用CCl 4诱导的肝硬化小鼠模型，通过肝部 分切除诱导肝再生反应，评估肝硬化小鼠肝再生能力， 观察再生肝组织的结构变化，为临床肝硬化治疗提供 实验依据。 1 材料和方法 Materials and methods 设计：随机对照动物实验。 时间及地点：于2012年1至12月在广州医科大学 基础学院组织学与胚胎学教研室完成。 材料： 实验动物：健康成
20、年昆明雄鼠60只，体质量28-35 g，清洁级，由广东省南方医科大学实验动物中心提供， 许可证号：SCXK粤2011 。 实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标 准的条例。 小鼠肝硬化部分切除后肝再生及其结构变化实验的主要 试剂及仪器： 方法： 肝硬化小鼠的肝再生模型制作及取材：将CCl 4与食用 粟米油以11比例混合备用。健康雄性昆明小鼠(n =60)皮 下 注 射 CCl4-粟 米 油 混 合 液 (6 mL/kg)， 2次 /周 ， 共 8周 。 随 机 选 取 5只 小 鼠 ， 取 肝 组 织
21、 制 作 切 片 ， 常 规 苏 木 精 -伊 红 染 色 ， 根 据 临 床 肝 纤 维 化 诊 断 分 期 标 准 ， 进 行 肝 组 织 病 理 学 鉴 定 7-8。 出 现 肝 实 质 广 泛 性 破 坏 、 肝 内 纤 维 增 生 、 假 小 叶 形 成 为 早 期 肝 硬 化 判 断 依 据 ， 进 一 步 对 肝 硬 化 小 鼠 实 施 肝 部 分 切 除 。 以 10 g/L戊 巴 比 妥 钠 (30 mg/kg)腹腔 注射麻醉肝硬化小鼠，按Higgins 等 9经典方法进行肝 部分切除动物模型改良，切除小鼠肝脏左叶、右叶， 保留中叶及胆囊、尾叶。在剑突下取正中切口，轻轻 挤出
22、肝脏左叶于肝蒂部结扎后切除，然后从剑突右下 方轻轻挤出右叶和后叶，并把右叶和尾叶一起结扎切 除。秤取并记录切除的肝左叶、右叶及尾叶质量(被切 除的各叶质量约占原肝质量的60%)，关闭腹腔。于肝 部分切除后1， 3，5，7 ，14，21 d腹膜下注射5-溴脱 氧尿核苷50 mg/kg，2 h后取小鼠残余肝组织并秤质量， 将各时间点所取的肝组织置于体积分数4%甲醛溶液中 固定，常规方法制做肝石蜡切片备用，另一部分置液 氮冻存，提取蛋白备用。 肝再生率计算方法 10： 试剂及仪器 来源 兔抗结蛋白多克隆抗体、兔抗 -平滑 肌肌动蛋白多克隆抗体、抗 5-溴脱 氧尿核苷单克隆抗体 兔二步法检测试剂盒、D
23、AB 显色试剂 盒 5-溴脱氧尿核苷 CCl4(500 mL/瓶) 粟米油 显微数码摄像分析系统 NewMarker 公司产品 北京中杉金桥生物技术有限公司 Sigma 公司产品 上海化学试剂一厂产品 市售 OLYMPUS 公司 郑晓筠，等 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org9198 www.CRTER.org 根据造模前、造模后小鼠肝质量计算肝再生率， 小鼠总肝质量按5.5%体质量计算。 肝组织病理学检测：切片行常规苏木精-伊红染色、 Masson 染色，光学显微镜下观察肝组织结构变化。 结蛋白、-平
24、滑肌肌动蛋白定性及定量检测、5 -溴脱氧 尿核苷显色：用免疫组织化学方法对结蛋白、-平滑肌 肌动蛋白进行定性检测，5-溴脱氧尿核苷免疫组织化 学方法显示5-溴脱氧尿核苷阳性标记细胞。肝组织切 片经熔蜡、水化、枸橼酸缓冲液抗原修复(5-溴脱氧尿 核苷免疫组织化学染色切片需用4 mol/L HCl预处理)、 30 g/L 过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶10 min后 滴加体积分数10%山羊血清封闭30 min，一抗 4 冰 箱过夜，PBS 冲洗后依次加二抗孵育 1 h，DAB显色， 苏木精复染、脱水、中性树胶封固，显微镜下观察。 常规Western Blot方法定量检测结蛋白、 -平滑肌肌动 蛋
25、白表达。 主要观察指标：肝再生率；肝组织病理学改变； 肝星形细胞标志分子结蛋白及其活化分子- 平滑肌肌 动蛋白的定性、定量表达；5-溴脱氧尿核苷标记。 统计学分析：由本文作者使用SPSS 10.0软件对 数据进行统计学处理。不同时间点肝再生率比较采用 配对t 检验，以 P 0.05表示对比组之间差异有显著性 意义。 2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 实验 共 选 用 雄 性 小 鼠 60只 制 作 肝 硬 化 模 型 ， 其 中 11只 在 造 模 过 程 中 死 亡 ， 存 活 49 只 ， 选 取 5只 小 鼠 用 于 组 织 病 理 学 鉴 定 ， 证 明 造 模 成
26、功 率 为 82%。 剩 余 的 44只 早 期 肝 硬 化 小 鼠 进 一 步 实 施 肝 大 部 切 除 ， 死 亡 4只 ， 术 后 存 活 率 88%。 肝 切 除 后 第 1， 3 天 分 别 取 5只 小 鼠 ， 其 余 时 间 点 各 取 6只 小 鼠 进 行 指 标 观 察 。 2.2 肝部分切除后的肝再生率 肝硬化小鼠肝部分切 除后第3天肝质量明显回升，见图1。 肝部分切除后第1，3 ，5，7 ，10，14，21天肝再 生率分别为 6.58%，22.03% ，21.39%，29.05% ，45.22%，50.9 8%，见图2。 2.3 肝部分切除前后肝组织的结构变化 见图3，
27、4。 苏木精-伊红染色结果显示，CCl 4皮下注射8周后 小鼠肝小叶结构破坏，肝细胞有空泡样变及脂肪变， Massson染色显示肝小叶间胶原纤维增生并伸入肝小 叶内形成间隔，与周围增生的纤维间隔互相连接、包 绕分割原来的肝小叶形成假小叶，呈现出早期肝硬化 改变。对肝硬化小鼠实施肝部分切除后第1-5天肝组织 结构与造模前肝织相比结构无明显变化；肝部分切除 后第7 天再生肝组织结构出现改善，随术后时间推移肝 细胞脂肪变现象逐渐减少，肝小叶间增生的胶原纤维 减少或消失，至肝部分切除后21 d肝小叶结构基本恢 复正常。 图 1 肝硬化小鼠肝部分切除后的再生肝质量 Figure 1 Liver mass
28、 of the mouse with liver cirrhosis after partial hepatectomy 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 再生肝质量(g) 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d 21 d 注：不同时间点再生肝的净质量，随术后修复时间的延长肝净 质量逐渐增加。 肝部分切除后时间 图 2 肝硬化小鼠肝部分切除后的肝再生率 Figure 2 Liver regeneration rate of the mouse with liver cirrhosis after partial hepatectomy 60 50 40 30 20
29、10 0 肝再生率(%) 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d 21 d 注：肝部分切除后不同时间点肝再生率逐渐递增。 肝部分切除后时间 A：CCl 4 皮下注射 8 周后肝组织 B：肝大部切除后 7 d 再生肝组织 郑晓筠，等 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9199 www.CRTER.org 2.4 结蛋白、-平滑肌肌动蛋白及5-溴脱氧尿核苷的 定性、定量检测 蛋白印迹检测结果显示，肝部分切除 后第1天再生肝组织内结蛋白表达量明显低于切除前， 但切除后第3-14天结蛋白表达呈上升趋势，21 d则
30、明 显减少，见图5。 与硬化肝相比差异均有显著性意义(P 0.05或P 0.01)；肝部分切除后各时间点 -平滑肌肌动蛋白表达 比切除前明显减少，肝再生过程中-平滑肌肌动蛋白 表达依时递减，与硬化肝相比肝部分切除后14 d及21 d的-平滑肌肌动蛋白表达差异均有显著性意义(P 0.05)，见图6。 免疫组织化学检测结果显示，结蛋白及-平滑肌 肌动蛋白阳性表达细胞均定位于肝血窦周围，见图7- 9。 A：肝部分切除前 图 3 肝硬化小鼠肝部分切除前后肝组织苏木精 -伊红染色病 理学变化(200) Figure 3 Pathological changes of liver tissue of mi
31、ce with liver cirrhosis before and after partial hepatectomy observed using hematoxylin-eosin staining (200) C：肝大部切除后 14 d 再生肝组织 D：肝大部切除后 21 d 再生肝组织 图 5 肝硬化小鼠肝部分切除前后结蛋白及 -平滑肌肌动 蛋白印迹检测结果 Figure 5 Western blot assay of desmin and alpha-smooth muscle actin before and after partial hepatectomy in mice w
32、ith liver cirrhosis 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d 21 d 肝部分 切除前 肝部分切除后 注：肝硬化小鼠肝部分切除前及肝部分切除后不同时间点肝组织结蛋 白及 -平滑肌肌动蛋白的 Western Blot 检测，GAPDH 为内参。 B：肝部分切除后 7 d C：肝部分切除后 14 d 图 4 肝硬化小鼠肝部分切除前后肝组织 Masson 染色病理 学变化(200) Figure 4 Pathological changes of liver tissue of mice with liver cirrhosis before and after partial
33、hepatectomy using Masson staining (200) A： CCl4 皮下注射 8 周后肝组织， 绿色为增生纤维，*示假小叶 B：肝大部切除后 7 d 再生肝组织， 假小叶消失 C：肝肝大部切除后 14 d 再生肝组 织，假小叶消失 D：肝大部切除后 21 d 再生肝组 织，假小叶消失 结蛋白 -平滑肌肌动蛋白 GAPDH 图 6 肝硬化小鼠肝部分切除前后结蛋白及 -平滑肌肌动 蛋白印迹检测的相对表达结果 Figure 6 Western blot assay of relative expression of desmin and alpha-smooth musc
34、le actin before and after partial hepatectomy in mice with liver cirrhosis 5 4 3 2 1 0 GAPDH 相对值 肝部分 切除前 肝部分切除后 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d 21 d 结蛋白 -平滑肌肌动蛋白 与肝部分切除前早期肝硬化组织相比， aP 0.05， bP 0.01。 注：结果显示，肝部分切除后第 5，7，14 天再生肝组织内结蛋 白表达量明显高于切除前，但切除后 21 d 则明显减少(P 0.05-0.01)。与硬化肝相比肝部分切除后 14 d 及 21 d 的 -平 滑肌肌动蛋白表达显著
35、低于切除前(P 0.05)。 a b b a a a 郑晓筠，等 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org9200 www.CRTER.org 3 讨论 Discussion 生理状态下肝为相对静止的器官，但在肝叶切除 或其他原因所致的肝细胞缺失后，残余的肝实质细胞 (成熟的肝细胞)及非实质细胞(包括胆管上皮细胞、肝 血窦内皮细胞、枯否细胞及Ito细胞)将先后进入增殖状 态以补充肝细胞数量、代偿肝脏功能 11-12。文献报道 正常小鼠肝部分切除后30 min 内便有早期反应基因的 表达，同时伴有转录因子STA
36、T3、活性核因子B的高 表达，细胞的DNA合成加速，从部分肝切除到肝细胞 DNA合成的启动只需10-12 h，合成高峰在术后24 h。 肝大部切除后,残余的肝细胞平均历经3/2(约1.67)个增 殖周期以完成肝的再生，整个过程持续 5-7 d13-17。 通常肝再生研究多采用Higgins 等 9的大鼠肝大部切除 模型，即切除肝左叶及中叶(占总肝质量的60%-70%)， 保留肝右叶及尾叶，近来也有许多研究将Higgins的肝 大部切除模型用于小鼠肝再生研究 12-14。考虑到小鼠 与大鼠胆道结构的差异，文章依照课题组改良后的肝 大部切除方法，保留小鼠贴近胆囊的中叶以保证胆汁 的正常流通，获得较
37、为理想的手术成活率 18。肝质量/ 体质量比、肝再生率等指标是评估肝再生状况的常用 指标，尤其是肝再生率排除了肝再生过程中体质量变 化的影响，能比较准确的反映肝再生情况。本实验综 合观察此2项指标，结果显示其变化趋势基本一致。已 有的研究证实正常小鼠在实施肝脏部分切除后，肝脏 可在7 -10 d恢复原有的质量，完成再生过程 19-20，本 实验中肝硬化小鼠部分切除后肝再生率及肝质量/体质 量比值变化相对缓慢，至术后21 d肝脏回复至原肝质 量的50%以上，说明与正常小鼠相比，早期肝硬化部 分切除可促进肝质量逐步恢复，尽管其再生的启动及 速度均有延后。 肝星形细胞的激活及增殖是肝纤维化发生过程中
38、 的中心环节，一些因素如毒素类、病毒、氧化应激、 坏死、细胞凋亡和生长因子均可诱导静止状态的肝星 形细胞激活分化为肌成纤维样细胞，此外，肝血管周 围成纤维细胞也可分化形成肌成纤维样细胞。活化后 的肝星形细胞(即肌成纤维样细胞)的表型特点为高增殖 图 7 肝硬化小鼠肝部分切除前后肝组织结蛋白免疫组化染 色结果(400) Figure 7 Immunohistochemical staining of desmin in the liver of mice with liver cirrhosis after partial hepatectomy (400) 注：结蛋白免疫组化染色，示结蛋白阳性
39、星形细胞。 D：肝部分切除后 21 d 图 8 肝硬化小鼠肝部分切除前后 -平滑肌肌动蛋白免疫组 化染色结果(400) Figure 8 Immunohistochemical staining of alpha-smooth muscle actin in the liver of mice with liver cirrhosis after partial hepatectomy (400) A：肝部分切除前 注：-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色，示位于肝细胞周围的 -平滑肌肌动蛋白阳性星形细胞。 B：肝部分切除后 7 d C：肝部分切除后 14 d D：肝部分切除后 21 d 图 9 肝硬
40、化小鼠肝部分切除前后 5-溴脱氧尿核苷免疫组化 染色结果(400) Figure 9 Immunohistochemical staining of 5-bromo-2- deoxyuridine in the liver of mice with liver cirrhosis after partial hepatectomy (400) A：肝部分切除前 注：5-溴脱氧尿核苷免疫组化染色，棕色胞核为 5-溴脱氧尿 核苷阳性细胞。 B：肝部分切除后 7 d C：肝部分切除后 14 d D：肝部分切除后 21 d 郑晓筠，等 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 ISSN 2095-4344
41、 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9201 www.CRTER.org 及迁移能力，表达-平滑肌肌动蛋白及各种细胞外信 号转导通路蛋白，并产生大量以胶原为主的细胞外基 质成分和细胞因子，导致肝组织微环境及结构的变化 21-22。近年陆续有研究报道肝内胆管上皮细胞也参与 肝星形细胞的活化和细胞外基质的生成，即肝内胆管 上皮细胞同样与肝纤维化过程相关，提示病理状态下 肝组织结构的异常变化是多细胞参与的一个复杂的过 程，其最根本的原因是病理环 境 下 各 相 关 细 胞 的 激 活 及 分 化 23。 本 实 验 肝 硬 化 模 型 组 织 病 理 学 检 测 结 果 表 明
42、CCl4处 理 8周 后 小 鼠 肝 实 质 内 将 出 现 明 显 的 肝 组 织 坏 死 、 小 叶 间 纤 维 组 织 增 生 及 典 型 的 假 小 叶 ， 达 到 早 期 肝 硬 化 分 期 标 准 24-25， 提 示 早 期 肝 硬 化 模 型 建 立 成 功 。 传 统 的 观 点 认 为 肝 硬 化 为 肝 脏 的 不 可 逆 病 变 ， 本 实 验 对 肝 硬 化 小 鼠 实 施 肝 部 分 切 除 后 发 现 随 术 后 再 生 时 间 的 延 长 ， 原 有 的 肝 硬 化 病 理 结 构 、 肝 脂 肪 变 及 空 泡 样 变 、 纤 维 增 生 等 现 象 明 显
43、减 弱 甚 至 消 失 ， 至 肝 部 分 切 除 后 21 d肝 脏 结 构 趋 于 正 常 ， 说 明 早 期 肝 硬 化 组 织 病 理 改 变 可 通 过 肝 部 分 切 除 得 以 纠 正 ， 但 其 前 提 是 有 效 控 制 肝 硬 变 的 诱 因 如 化 学 损 伤 、 病 毒 感 染 等 。 结蛋白是肝星形细胞的标志分子，当肝星形细胞 向肌成纤维样细胞转化后则表达 -平滑肌肌动蛋白， 故-平滑肌肌动蛋白阳性表达可做为肝星形细胞激活 的标志 26-29。 本实验发现肝脏术后再生修复过程中结蛋白表达 量依时递增，肝部分切除后14 d达峰值，至肝部分切 除后21 d结蛋白表达量降低
44、，提示肝星形细胞的增殖 在肝部分切除后早期较活跃，肝硬化术后所启动的再 生微环境中增殖的肝星形细胞可能参与了肝组织的重 建。正常情况下肝脏-平滑肌肌动蛋白仅表达于血管 壁平滑肌细胞及活化的肝星形细胞 30-32，本实验中早 期肝硬化部分切除后-平滑肌肌动蛋白阳性表达与结 蛋白阳性细胞增殖并不同步，随着术后肝修复时间的 延长-平滑肌肌动蛋白表达则逐渐减少，其可能的原 因是：该再生环境可刺激肝星形细胞的增殖但抑制 其活化。增殖的肝星形细胞向肝实质细胞或其他细 胞方向分化。既往对肝星形细胞的研究主要关注于其 在肝纤维化进程中的作用，认为在损伤因子刺激下活 化的肝星形细胞是肝纤维化发展的核心环节。近来
45、不 断有证据证实肝星形细胞具有促进肝组织再生的作用， 研究发现肝星形细胞活化受限的小鼠在肝损模型中随 损伤持续加重，肝组织修复明显受限 32；另有报道在 胚胎干细胞诱导分化为肝细胞体系中，将胚胎干细胞 与永生化肝星形细胞等肝间质细胞共培养，诱导分化 效率明显提高 33-34，提示肝星形细胞的功能状态与肝 细胞的分化成熟及功能活性密切相关，肝星形细胞可 能参与肝细胞的分化和成熟，上述观点与本文结果吻 合，具体机制仍需深入探讨。 5-溴脱氧尿核苷可代替胸腺嘧啶在DNA合成期选 择性的掺入到处于细胞周期S期的细胞单链DNA核苷酸 序列中，做为DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，5-溴 脱氧尿核苷能准确反
46、映细胞的增殖状态，对研究细胞 动力学有重要意义 35。 正常小鼠肝大部切除后1 d即出现5-溴脱氧尿核苷 阳性标记细胞 18，本实验采用 5-溴脱氧尿核苷标记技 术定性观察肝内再生细胞，结果发现术后5 d肝内逐渐 出现5 -溴脱氧尿核苷阳性标记细胞，表明早期肝硬化 部分切除同样能启动再生反应但其再生反应的启动较 正常小鼠慢。结合肝组织结构特征及5-溴脱氧尿核苷 阳性标记细胞的定位进行判断，肝部分切除后第1周各 时间点内的5-溴脱氧尿核苷阳性反应主要定位于肝细 胞，而肝部分切除后14-21 d 5-溴脱氧尿核苷阳性细 胞主要为血窦内皮细胞、肝星形细胞及肝血窦腔内的 血细胞。本实验未对各5-溴脱氧
47、尿核苷阳性细胞进一 步分型，但根据组织学形态及位置判定，肝硬化肝部 分切除后肝实质细胞最先启动增殖反应，其后则通过 肝非实质细胞的增殖来补充和完成肝组织的再生。 实验结果表明早期肝硬化部分切除可明显改善甚 至逆转硬化肝的组织结构，然而肝硬化部分切除后肝 内有效增殖细胞数的相对减少及肝再生反应滞后等因 素，是临床上不可忽视的重要环节，在实际应用中应 根据肝功能代偿能力等指标进行科学评估。肝硬化早 期进行手术治疗，结合保肝护肝药物，将有望延缓或 阻断肝硬化进程。 作者贡献 ：郑晓筠、罗倩欣、 陈倩琪 负责实验设计，郑晓 筠、罗 倩欣、陈倩琪、熊喜峰负责实验实施，熊喜峰及刘玉荣 负责实验评估，郑晓
48、筠、 罗倩欣、陈倩琪负责资料收集及成文， 马宁芳审校并对文章负责。 利益冲突 ：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组 织直接或间接的经济或利益的赞助。 伦理要求 ：实验过程中对动物的处置应符合 2009 年 Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学 标准的条例。 学术术语 ：肝假小叶-肝硬化时肝内纤维组织广泛增生， 把原有的正常肝小叶分隔、包绕为 大小不一、 圆形或类圆形的 肝细胞团块，形似肝小叶，小叶内中央静脉常偏位或缺如，称 假小叶，为肝硬化的一个重要形 态 学标志。 作者声明 ：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密， 无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他 人课题以及专利技术的争执，内容真实，文 责自负。 4 参考文献 References 1 范婷婷,谢渭芬.肝纤维化和肝硬化治疗进展J.国际消化病杂志, 郑晓筠，等 . 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org9202 www.CRTER.org 2010,30(6): 349-351. 2 Schuppan D, Kim YO. Evolving therapies for liver fibros
