1、1 分离组织膜蛋白的方法： 1、取组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、J6-HC 离心机 800rpm，4离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g， 4离心 1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B 重悬，冰上孵育 2hr 后分 装至 EP 管， Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4离心 30min。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5） ，120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupe
2、ptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 Buffer B：20mM HEPES（ PH 7.5） ，10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预 冷。 2 取约 0.1g 肝组织，加入 2ml 粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次 20 秒，间隔 30 秒，共 3 次，4c 105xg 条件下离心 2 小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入 1ml 胞膜蛋白提
3、取液，超声粉碎，4c 105xg 条件下离心 2 小时，上清液为 胞膜蛋白。样品蛋白含量测 定采用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1 将细胞种于 T75 或 T175 的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将 PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培 养箱或在超净台内消化 35 分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。 2 收集细胞悬液于 10 毫升或 50 毫升的离心管中，1000rpm 离心 10 分钟，去上清液。 3 按 2.5 毫升（T75）/每瓶或 5 毫升（T17
4、5/ 每瓶加入冰冷的匀浆液 （HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆 器中，匀浆。 4 将匀浆液转入离心管中，加入适量的 Tris HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10 分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的 tris-HCl buffer. 4 度 18000rpm(40000g)离心，共离心三次。 5 在最后一次离心得到沉淀中按 250 微升每瓶（T75）或 500 微升每瓶（T175）加入 tris-HCl buffer，匀浆，取 50 微升匀浆液测量
5、蛋白浓度。 6 按实验要求，将匀浆分装于 1 毫升的 Eppendoff 管中，其于 -80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在 40000g 时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具 体的 protocol 可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位 是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则 需要用无水甲醇在-20 度处理 10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进 入细胞内与蛋白结合。 4 一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法分离
6、，可是我们现有的离心机 都无法达到所需要的转速，所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的办法。 1） 预冷的 pbs 洗去组织血液，除去结缔组织、脂肪。 2） 4 剪碎，加 bufferA 玻璃匀浆器匀浆至无大块状物，10 超声波 10min，重悬，再破 碎 510min。 3）12000rpm 离心 10min，沉淀用 bufferB 重悬，20 超声波 10min。 4）12000rpm 离心 10min，沉淀用 bufferC 抽提。 5）12000rpm 离心 10min，所得上清含有 9%的膜蛋白。 6）12000rpm 离心 10min，沉淀加 bufferD 沸水煮 5min， 120
7、00rpm 离心 10min，上清含有 1%的膜蛋白。 bufferA: 40mM Tris base bufferB: 8M urea ,100mM DTT, 40mM Tris base bufferC: 6-7M urea, 0.2mmol/L PMSF,40mM Tris base bufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycerol,in 0.4M Tris-HCl pH8.8 我们做的是动物组织的膜蛋白,提出来电泳条带还可以,只是我们没有专一膜蛋白抗体来检测 提出来的是否是膜蛋白.但是这个方法是可行的 5 三、 蛋白提取操作步骤 实体组织蛋白的提取 1、 组织
8、样本（200300mg ）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎； 2、 组织样本中加入 1mL Lysis Buffer（注：使用前，每 mL Lysis Buffer 加入 1L 蛋白酶 抑制剂和 1L 1M DTT） ，置玻璃均浆器冰上均质 3050 次（或超声破碎细胞，每次 30 S ， 34 次，每次间隔 1 min） ， 置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破 碎率不小于 90； 3、 将均浆液转移至冷的离心管中，于 4, 3000 rpm 离心 10 min，弃沉淀； 4、 取上清转移至新冷离心管中，于 4, 14 000 rpm 离心 30 min，所得上
9、清转至新管中， 即为胞浆蛋白，分装冷冻保存； 5、 取沉淀，加入 1mL 冷的抽提 Buffer， 涡旋振荡混匀后，4放置 10 15min； 【注：因抽提 Buffer 在室温时会分层，请务必于 4混匀后加入】 6、 4, 3000rpm 离心 5min，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清） ，进行下步提 取； 7、 置于 37水浴 10min； 8、 室温,13 000rpm 离心 5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白） ； 【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管，可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层 因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。或室温静置 30 分钟1
10、小时 亦可见分层。以下亦同。 】 9、 取下层，加入 500L 冰冷灭菌水，4放置 5min； 10、置于 37水浴 10min； 11、室温,13 000rpm 离心 5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白） ； 12、取下层，加入 500L 冰冷灭菌水，4放置 5min； 13、置于 37水浴 10min； 14、室温,13 000rpm 离心 5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白） ； 15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物，BCA 法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测 定结果，此含量为相对参考值） ，分装冷冻保存。 6 用 RIPA 强配方，把脱氧胆酸钠浓度调整至 1.0%，同时加入
11、 NP-40 和 Triton X-100，浓度 均为 1%。我刚做了一个 7 次跨膜蛋白， LHR 的 WB。 7 提取总蛋白的方法不能用于膜蛋白的提取，提供一个常用的方法：先分离膜，在提取膜蛋 白。这类方法在园子里有不少介绍。我们实验室曾经采用蔗糖梯度超速离心分离膜，据说 效果还可以。您可以试一下。呵呵- 8 细胞破碎后，先低速离心,除去未破碎的细胞和大的细胞碎片。保留上清，超速离心，可获 得细胞膜。然后用 detergent 溶液萃取，就可以得到膜蛋白溶液了。 9 - 我有新的问题了。 。 。哪位仁兄有好的提取细胞膜蛋白的裂解液配方。 。 。我的膜蛋白总提不 出来。 我的细胞是 HEPG
12、2；目的蛋白是 LDL 受体； 我的配方是这样的： 4%CHAPS , 8 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride 但是总提不出来。 。 。 。急！ 呵呵，CHAPS 提取膜蛋白能力较差，尝试加入 1ASB-14 ，或者加入 1Triton X-100, 与 CHAPS 联合抽提。 另外最好加入 2M thiourea。 祝好运 1.6% Triton X-100, 5 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L pheny
13、lmethylsulfonyl fluoride ;2M thiourea; thiourea 很贵吗？我现在没有，又要急着用，能不能不用 thiourea? thiourea 不是很贵，merck250g 才 300 多 rmb。电泳时可以考虑用 ASB-14，sb3-10。没有的 话，提取最好加点 NP-40，2M thiourea 还是要的，要是有 TBP 就更好了。 NP lysis buffer. NP 配方，stock solution 20ml (50mM Tris-HCL (PH8.0), 5mMEDTA, 0.05%NaN3, 0.14M NaCL, 100mM NaF),
14、1% Nonidet P40, 0.2TIU/ml aprotinin, 1.5uM pepstatin A, 20mM Iodoacetamide. NP 配好后分装，-80 度保存。用之前，加入 NaV 和 PMSF。混匀后立即置于冰上。 10 如果你研究的蛋白表达比较丰富没有必要提取膜蛋白，直接用 RIPA 裂解液裂解后离心取 可溶性蛋白变性做 WB 就可以了；如果你蛋白的含量低或抗体特异性很差的话，你应该用 试剂盒或超速离心提取膜蛋白，可以起到富集和纯化的作用，使你更容易得到好的结果！ 11 RAPI 的裂解液只能说是强的非变性裂解液,而算不上是强的变性裂解液. 提取膜蛋白一般都在变性
15、条件下才可以. 所以,你应该改用其他更适合的强的变性裂解液,如含 SB3-10、DM、ASB-14 等膜助溶剂,或 者 SDS-Bolied loading bufffer,2-D 裂解液 7M thiourea+2M urea 也可以 12 - 组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行 （1）取组织，用 PBS 冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪 碎组 织,于冰上充分匀浆。每次 30 秒,重复 3-5 次. （2）离心机 1000rpm，4 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织 及结缔组织) （3）100000g，4 离心 1hr,
16、 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用 10000rpm, 4 度, 30 分钟离心，取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B 重悬，4 度过夜后，分装至 EP 管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4 离心 30min。 （4）收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5） ，120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 Buffer B 2
17、0mM HEPES（PH 7.5） ，10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 所得蛋白分装 EP 管（每管约 50ul） ，取一管测蛋白浓度，其它放入 -70 度深冻冰箱保存。 如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4 度保存。反复冻融蛋白 会降解，浓度不准。 13 我用来抽提大鼠脑组织细胞膜蛋白方法： 取两只大鼠的整个脑组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。J6-H
18、C 离心机 800rpm，4离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。100000g，4离心 1hr。弃去上 清，沉淀用适量的 Buffer B 重悬，冰上孵育 2hr 后分装至 EP 管， Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4离心 30min。所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5） ，120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 Buffer B：20m
19、M HEPES（PH 7.5） ，10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。 CHAPS(一种离子去污剂）是提取膜蛋白的常用试剂一般用 10mMol 的浓度即可，你可以试 试加到你的 Buffer 中，看效果如何。不过此药品很贵！ lysis buffer 的选择依赖于你所研究蛋白质的位置和性质： 1）细胞浆蛋白（可溶性）： Tris Buffer 2）细胞浆蛋白（结合到细胞骨架）：Tris-Triton
20、buffer 3) 膜结合蛋白：Np-40 或 RIPA 4）核蛋白：RIPA 5）线粒体蛋白：特殊的抽提裂解液 6）全细胞蛋白：Np-40 or RIPA Western blot Adipose tissue membrane protein was extracted from approx. 20mg of adipose tissue. PAGE was performed according to Laemmli 8. A portion of 2g of adipose tissue membrane protein was applied per lane. In additi
21、on, 10g of mononuclear cell membrane protein (corresponding to 1.7106 mononuclear cells) was applied and used as a positive control for verification of blotting, incubation and detection. Tank blotting to nitrocellulose was performed according to standard protocols, with transfer for 3h at 70V and 1
22、5C. The blots were incubated with 1g/ml rabbit anti-(human b2-adrenoceptor) IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc.), and were then re-incubated with alkaline phosphatase-labelled goat anti- rabbit antibody. Detection was performed using DDAO 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2- one-7-yl) phosphate (P
23、ro-Q Western Blot Stain Kit; Molecular Probes Inc.) on a Fujifilm FLA- 3000 instrument. Quantification of b2-adrenoceptor protein was performed by determining the fluorescence intensity of b2-adrenoceptor-antibody-immunoreactive bands. The concentration of b2- adrenoceptor protein is expressed as th
24、e intensity of the immunoreactive bands of the tissue samples in relation to the intensity of the immunoreactive bands of the mononuclear cell membrane protein internal standard. Like others before us trying to isolate the b2-adrenoceptor 9, we observed several immunoreactive bands on our Western bl
25、ots ( Figure 1). On all blots we found a single major band at 57kDa and several smaller immunoreactive bands (3852kDa). The b2-adrenoceptor is known to have a molecular mass of 64kDa and to be very fragile, so the immunoreactive bands on our blots must represent proteolytic degradation products and/
26、or secondarily modified b2-adrenoceptor. When trying to quantify the receptor it is therefore uncertain whether to include all visible bands total band area (T) or to include only the single major band (S). We have done both. Figure 1 shows the area included in determining the intensity of the singl
27、e major band and total band area intensity. All blots were loaded with the same amount of membrane protein per well, but since we wished to determine the level of protein expression in relation to individual cells, the concentration is expressed as intensity of b2-adrenoceptor protein per ng of DNA.
28、 The coefficient of variation based on 13 double determinations was 28% for total band area determinations and 29% for single major band determinations 14 凯基膜蛋白提取试剂盒 凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 一、描述:本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。其原理是裂解细胞后，先 离心分离出质膜粗提物，再利用特殊的抽提 Buffer，选择性地分离提取膜蛋白，抽提 Buffer 含一种特殊的去污剂，在 4时所有的蛋白质均可都溶于抽提
29、Buffer，但在 37时， 抽提 Buffer 分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中， 根椐该性质分离出膜蛋白。产物不仅含细胞膜蛋白，也含胞器质膜蛋白。提取方法简单， 可靠，快速。获得的膜蛋白纯度高，可用于 PAGE 电泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后 续研究。 二、试剂盒组份 组份 KGP350（50 tests） KGP3100（100 tests） Lysis Buffer 50 mL 25 mL 4 抽提 Buffer 50 mL 25 mL 4 蛋白酶抑制剂 50L 100L 溶解 Buffer 15 mL 30 mL TCA 试剂 5
30、 mL 10 mL Loading Buffer 1 mL 2 mL DTT(1M) 50L 100L 三、 蛋白提取操作步骤 实体组织蛋白的提取 1、 组织样本（200300mg ）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎； 2、 组织样本中加入 1mL Lysis Buffer（注：使用前，每 mL Lysis Buffer 加入 1L 蛋白酶 抑制剂和 1L 1M DTT） ，置玻璃均浆器冰上均质 3050 次（或超声破碎细胞，每次 30 S ， 34 次，每次间隔 1 min） ， 置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎 率不小于 90； 3、 将均浆液转移至冷的
31、离心管中，于 4, 3000 rpm 离心 10 min，弃沉淀； 4、 取上清转移至新冷离心管中，于 4, 14 000 rpm 离心 30 min，所得上清转至新管中， 即为胞浆蛋白，分装冷冻保存； 5、 取沉淀，加入 1mL 冷的抽提 Buffer， 涡旋振荡混匀后，4放置 10 15min； 【注：因抽提 Buffer 在室温时会分层，请务必于 4混匀后加入】 6、 4, 3000rpm 离心 5min，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清） ，进行下步提 取； 7、 置于 37水浴 10min； 8、 室温,13 000rpm 离心 5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白） ； 【
32、注：建议使用进口透明性较好的微量离心管，可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层 因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。或室温静置 30 分钟1 小时 亦可见分层。以下亦同。 】 9、 取下层，加入 500L 冰冷灭菌水，4放置 5min； 10、置于 37水浴 10min； 11、室温,13 000rpm 离心 5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白） ； 12、取下层，加入 500L 冰冷灭菌水，4放置 5min； 13、置于 37水浴 10min； 14、室温,13 000rpm 离心 5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白） ； 15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物，BCA
33、 法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测 定结果，此含量为相对参考值） ，分装冷冻保存。 四、 SDS PAGE 电泳操作步骤 1、 进行 PAGE 电泳前，取该提取物，每 100L 膜蛋白提取物，加入约 300L 的溶解 Buffer 和约 100L 三氯乙酸 （TCA）试剂， 混匀后置冰上 2030 min 后， 13 000rpm，离心 15 min，尽可能除去上清； 2、 沉淀加入 1mL 丙酮，室温静置 10min 后，13 000rpm 离心 15 min； 3、 弃上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥约 10 min（敞开离心管盖） ，加入适当体积的 Loading Buffer（使用
34、前每 100L Loading Buffer 加入 25L 巯基乙醇）溶解，彻底分散 （枪头反复吹吸或剧烈涡旋） ； 【注：加入 Loading Buffer 后如有部分难溶物，可取上清继续上样；如加入 Loading Buffer 后溴酚蓝转呈黄色，此为少量 TCA 残留所致，不影响电泳结果。请参照 Marker 标准。 】 4、 上样进行 SDS PAGE 电泳。 五、 注意事项： 1、 所有的试剂及器具均需预冷后使用。细胞或组织量需达到要求。 2、 抽提 Buffer 4时，为混悬状态，请于此温度下混匀后吸取加入粗提物中。 3、 室温 25 37时，抽提 Buffer 需静置 30 分钟以上可看到分上下两层，其中约 9/10 至 4/5 为上层水相，下层只占 1/10 至 1/5 为有机相。 4、 因产品采用不透明的包装瓶，因此无法观察到上述分层现象，可将该 BUFFER 倒入玻 璃烧杯或试管中静置 30 分钟1 小时可见分层。 5、 TCA 试剂具强腐蚀性，操作时请带合适的手套并注意防护。 六、 储存 蛋白酶抑制剂-200C，Loading Buffer 室温保存，其余 40C，保存一年
