1、糖化温度、pH 值、时间、原料对酚酸和氨基酸溶解的影响 华润雪花啤酒（河北）有限公司 石秀云 摘译 【摘要】本文旨在研究小麦啤酒最佳的糖化条件。糖化工艺参数，如温度、pH 值、时间应提供淀粉酶和蛋白酶最佳的酶解条件，使阿魏酸、对香豆酸、氨基 酸最大程度溶解。这些酚酸是挥发性芳香酚类物质 4-乙烯基苯酚（4VP）和 4- 乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前体物质。高级醇和酯类物质，如苯乙醇、乙酸 异戊酯，决定着小麦啤酒的风味和口感。最佳的糖化条件还应降低含苯乙烯基 类物质的溶解度。苯乙烯类物质普遍存在于谷物中，小麦啤酒酿造过程中在加 热和酶促作用下转化为有害物质苯乙酸。试验参数，特别是糖化 p
2、H,对试验目 的的实现起着决定性作用。此外，还研究了不同麦芽和原料对酚酸和氨基酸溶 解的影响。 【关键词】氨基酸、苯丙烯酸、阿魏酸、糖化条件、对香豆酸、小麦啤酒香气 引言 酚酸广泛存在于各种香草和麦芽制品中。其中阿魏酸、对香豆酸是 4-乙烯 基苯酚（4VP）和 4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前体物质，是重要的酚酸物 质，对啤酒风味起重要作用。这些酚酸在酶促或加热作 用下生成相应的多酚（见图 1） 。阿魏酸，最常见的羟 基肉桂酸，多通过酯键与多糖交联存在于植物细胞壁中。 这种结构能被各种酶酶解成相应的物质：被阿魏酸酯酶 酶解成阿拉伯糖和阿魏酸；被 -(1-4)木聚糖内切酶 酶解成低聚木糖
3、；被 -D- 木糖酶酶解成木糖和低聚木糖；被 L-阿拉伯呋 喃糖酶酶解成相应的阿拉伯呋喃糖。因而，阿魏酸对植物细胞壁的稳定性与弹 性有着显著作用。此外，阿魏酸也是一种抗氧化剂，能清除自由基。糖化过程 中，粮食内的苯丙烯酸同阿魏酸、对香豆酸一起溶解出来，在加热或酶解下脱 羧降解成苯乙烯，而苯乙烯对小麦啤酒风味无显著作用。 高纯苯乙烯是种可挥发性芳香液体，合成聚苯乙烯的单体。而聚苯乙烯用 于制作各种绝缘体及一次性泡沫饭盒。国际癌症研 究机构已将苯乙烯归为很可能致癌物质（B 组） ，暂 定每日允许摄入量为 0.4ug/kg(体重)。按照暂定每 日允许摄入量摄入苯乙烯，可能危害人体健康。目 前检测出各
4、种小麦啤酒麦汁中的苯丙烯酸含量在 75ug/l 和 375ug/l 之间，低于阿魏酸和对香豆酸含 量,而小麦啤酒中苯乙烯浓度高于 24ug/l。 与酚酸相似，在羧肽酶、二肽酶、氨基肽酶酶解下，氨基酸溶解出。发酵 过程中，在酶的作用下，氨基酸被酵母代谢合成为酯类和高级醇类的前体物质。 氨基酸，特别是苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸对小麦啤酒水果味和麦芽味起决定 性作用。酵母通过 Ehrlich 途径合成发酵液中的高级醇和酯类物质（见图 2） ， 如苯乙醇、异丁醇、正丙醇、甲硫醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯酯、乙 酸己酯. 表 1 给出了部分氨基酸及其相应的高级醇和酯类物质。4VG、4VP 和前 面提到
5、的芳香物质决定着小麦啤酒的风味和口感。 表 1：部分氨基酸及其相应的高级醇和酯 氨基酸 高级醇 酯 亮氨酸 异戊醇 乙酸异戊酯 异亮氨酸 戊醇 乙酸戊酯 苯丙氨酸 苯乙醇 乙酸苯乙酯 蛋氨酸 甲硫醇 乙酸甲硫酯 除考虑麦芽水分、发芽温度、时间、干燥温度对糖化过程的影响，本文旨 在寻找最佳的糖化条件，提供最适的酶解条件，使阿魏酸、对香豆酸、氨基酸 最大程度溶解，同时减少苯丙烯酸的产生。此次研究中，主要考虑糖化温度、 pH、时间及麦芽色度。 试验材料与方法 试验材料 所有分析物和试剂都是分析级或色谱级，其中，苯丙烯酸、对香豆酸、甲 醇、冰乙醇由 Sigma-Aldrich(Steinheim,Ge
6、rmany)提供。 酚酸含量测定方法 如 Schwarz 等发现，使用安捷伦高效液相色谱（Agilent 1100 HPLC-DAD ）检测苯丙烯酸、阿魏酸、对香豆酸。使用 AppliChrom OTU Li-poMare C18 (250 mm * 4.6 mm *5 pm )(AppliChrom.Oranienburg)检测各类酚酸。 通过不 同的紫外检测波段最终区分苯丙烯酸（280nm） ，对香豆酸、阿魏酸(312nm)。 氨基酸含量测定方法 使用 EZ （Phenomenex,Aschaffenburg.German）和 GC-FID(Hewlett- Packard 5890)分析
7、样品中游离氨基酸。 糖化温度影响的分析方法 采用以下试验来研究糖化温度对酚酸和氨基酸浸出的影响：分别磨碎 40g 比尔森啤酒麦芽和裸小麦芽，加入 300ml 热水糖化。依据 Vanbeneden 等人的 研究，在 25 到 80之间，进行恒温糖化，pH 值设定为 5.4。样品分别处理 30,60,120 及 180 分钟，然后立即使用 100ml 冰水冷却，5ml 冰醇酸调酸灭酶。 调整溶液到 500g 后，离心 5 分钟（10，000rpm） ，上清液冷藏于-18待分析。 糖化 pH 影响的分析方法 添加 300ml 水后，使用 1N 氢氧化钠溶液或 1N 盐酸溶液将料液 pH 分别调至 4
8、.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8 ，于 45下分别糖化 60 分钟。 糖化时间影响的分析方法 45，pH5.4 条件下，样品分别糖化 10,20,30,45,60,75,90,105,120,180,240 和 300 分钟。 不同麦芽和原料影响的分析方法 分析不同色度（1.8-300EBC）着色麦芽和各种粮食（大麦、小麦、黑麦） 对酚酸、氨基酸溶解的影响。麦芽由 Weyermann (德国,班贝克)提供。45， pH5.4 条件下，样品分别糖化 60 分钟。 统计分析 所有试验至少重复两次。每一组试验麦汁在同一水平下
9、进行分析，结果用 偏差表示。 结果与讨论 糖化温度的影响 为研究糖化温度对麦汁（小麦麦芽：哈雷麦芽=50%：50%）酚酸（苯丙烯酸、 阿魏酸、对香豆酸）和氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、蛋氨酸）溶解的影响， 样品在 25-80间进行恒温试验。 从图 3 可以看出糖化温度对阿魏酸溶解的影 响。整体来看，45时阿魏酸溶解量最大，这与 目前的研究结论一致（40、43、45） 。考虑 糖化时间（30 分钟、60 分钟） ，50时阿魏酸溶 解量最大。25-60间，糖化时间越长，阿魏酸溶 解量越大。65以上，糖化时间对阿魏酸溶解没 有显著影响，因为这个温度范围内，大多数阿魏
10、酸降解酶已失活。Vanbeneden 和 McMurrough 等人也 有类似的发现。 从图 4 可以看出糖化温度对苯丙烯酸相似的影响 趋势。45和 50时，苯丙烯酸溶解量最大。从试验 数据来看，60以内，糖化时间越长，物质浸出越多； 65以上，糖化时 间对物质的浸出没 有显著作用。 图 5 中没有显示对香豆酸最佳的溶解温度。 在 30-35、45-50均出现对香豆酸溶解峰 值。与苯丙烯酸、阿魏酸相比，随着糖化时间 的延长，对香豆酸溶解量并没有增加。糖化时 间超过 120 分钟，延长糖化时间可以降低对香 豆酸的溶解。65以上，随着温度的上升，对 香豆酸溶解量明显降低。 图 6 显示，糖化温度
11、50时，氨基酸浓度出现峰 值。检测的氨基酸中，亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、 丙氨酸峰值较高（c200mg/l） 。而蛋氨酸峰值最低 （芳香物质甲硫醇和甲硫代丙醛的代谢前体，这两种 物质风味阈值非常低） 。 糖化 pH 的影响 在 45下，糖化 60 分钟，研究不同 pH（4.2-6.8） 对酚酸和氨基酸溶解的影响。从图 7 可以看出 pH 对阿魏 酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解的影响。对阿魏酸来说， 最适 pH 为 5.4-6.6。Vanbeneden 等人研究发现最佳 pH 为 5.8，也有研究表明相关酶的最适 pH 在一定范围内。 对对香豆酸来说，出现两个最适 pH 范围： 4.4-4.6、5.
12、8- 6.0。对苯丙烯酸来说，呈现下降趋势，醪液越接近中性， 苯丙烯酸的溶解量越大。 从图 8 可以看出，pH 值 5.2-5.4 时，氨基酸含量出现 峰值。这与目前研究的最适 pH5.2 是一致的。从图 6 也可以 得到相似的结论。 糖化时间的影响 图 9,10 显示不同糖化时间对酚酸和氨基酸溶解的影 响，研究从 10 分钟持续到 300 分钟，使用小麦芽和大麦 芽。图表 9 显示糖化时间对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯 酸溶解量的影响。对阿魏酸来说，糖化时间与阿魏酸溶 解量呈献性关系（R 2=0.98） ，10 分钟时，阿魏酸含量 0.7 mg/l,300 分钟时，阿魏酸含量为 7.8 mg/l
13、。与阿魏 酸相似，整个糖化过程中，苯丙烯酸含量呈线性增长趋 势。但 240 分钟后，溶解量维持在相近水平（0.4 mg/l） 。 105 分钟到 120 分钟，对香豆酸出现峰值（0.9 mg/l） ， 然后不断降低直至糖化结束。从图 5 也可看出，120 分 钟后，对香豆酸溶解量快速降低。 从图 10 可以看出，随着糖化时间的延长，氨基酸 溶解量不断增加。120 分钟后，氨基酸已基本溶解。这 与糖化温度、pH 影响的研究结论是一致的。 着色麦芽和不同原料的影响 不同原料（小麦、大麦、黑麦）和着色麦芽（1.8-430EBC）中酚酸和氨基 酸含量是不同的。45下分别糖化 60 分钟，来研究不同原料
14、及麦芽对阿魏酸、 对香豆酸、苯丙烯酸溶解的影响（图 11） 。所有样品中，黑麦麦芽样品中阿魏 酸和对香豆酸溶解度最高，但苯丙烯酸的溶解量与其他样品相近。从大麦绿麦 芽到比尔森麦芽，所有酚酸含量呈上升趋势。与小麦麦芽和比尔森麦芽相比， 大麦制成的麦芽样品酚酸含量偏高。与浅色小麦麦芽相比，深色小麦麦芽样品 中酚酸含量偏低。整体来讲，色度 2-74EBC，麦芽色度与酚酸含量没有明显的 关联性。此外，色度超过 91 EBC 样品中，没有检测到酚酸物质，这与 Inns 等 人的研究是一致的，他们也没有发现麦芽干燥温 度与酚酸明显的关联性。图 12 显示不同原料及麦 芽对氨基酸的影响趋势。从大麦到绿麦芽再
15、到比 尔森麦芽，氨基酸溶解量趋势与酚酸相似。与酚 酸相比，黑麦麦芽样品中各类氨基酸溶解量与深 色小麦麦芽样品相似。因而，麦芽色度与氨基酸 含量没有明显的关联性，如特种麦芽 Caraamber 色度高，氨基酸溶解量也高。 其它特种麦芽中也有少量氨基酸溶解。与 pH、时间、温度影响试验相同，在此 试验过程中，丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸被大量检出。 结论 通过试验研究糖化 pH、时间、温度对酚酸及氨基酸溶解的影响，寻找增加 芳香前体物质如阿魏酸、对香豆酸溶解量，同 时降低苯丙烯酸含量的最适糖化条件。同阿魏 酸、对香豆酸一样，苯丙烯酸在 45-50糖化 温度下也可溶解。延长糖化时间可以促使这三
16、种物质溶解。因此，相关参数的确定是相当困 难的。 试验证实，随着 pH 值的增加，苯丙烯酸 的溶解度不断增加。将麦汁调酸至 pH 值 5.2- 5.4，可使苯丙烯酸的溶解度降低。在这个 pH 值范围内，游离氨基酸溶解量增 加，这些氨基酸是构成芳香物质高级醇和酯类的前体物质，但阿魏酸和对香豆 酸的溶解度有微量降低（见表 2） 。目前研究表明，前体物质的数量与芳香物质 的量没有必然联系，酵母菌株、发酵温度、进一步生产过程都显著影响小麦啤 酒风味。如在酯类形成过程中，含氮物质浓度，可发酵糖，脂类物质也有重要 作用。且芳香物质对酒体风味的影响取决于其嗅觉阈值。 表 2: 酚酸和氨基酸溶解最适糖化条件 时间，min 温度， pH 值 阿魏酸 300 45 5.4-6.6 对香豆酸 105-200 30-35 45-50 4.2-4.8 5.8-6.0 苯丙烯酸 240-300 45-50 6.8 氨基酸 120 50 5.2-5.4 摘译自：Release of Phenolic Acids and Amino acids During Mashing Dependent on Temperature ,pH ,Time and Raw Materials.Journal of the ASBC The Science of Beer(2012), 70(4),219-332
