1、简 介 蓝 白 斑 筛 选 蓝 白 斑 筛 选 是 一 种 基 因 工 程 常 用 的 重 组 菌 筛 选 方 法 。 野 生 型 大 肠 杆 菌 产 生 的 -半 乳 糖 苷 酶 可 以 将 无 色 化 合 物 X-gal(5-溴 - 4-氯 -3-吲 哚 - -D-半 乳 糖 苷 )切 割 成 半 乳 糖 和 深 蓝 色 的 物 质 5-溴 -4-靛 蓝 。 有 色 物 质 可 以 使 整 个 培 养 菌 落 产 生 颜 色 变 化 ， 而 颜 色 变 化 是 鉴 定 和 筛 选 的 最 直 观 有 效 的 方 法 。 编 辑 本 段 适 用 方 面 设 计 适 用 于 蓝 白 斑 筛 选
2、 的 基 因 工 程 菌 为 -半 乳 糖 苷 酶 缺 陷 型 菌 株 。 这 种 宿 主 菌 的 染 色 体 基 因 组 中 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 的 基 因 突 变 ， 造 成 其 编 码 的 -半 乳 糖 苷 酶 失 去 正 常 N 段 一 个 146 个 氨 基 酸 的 短 肽 （ 即 肽 链 ） ， 从 而 不 具 有 生 物 活 性 ， 即 无 法 作 用 于 X-gal 产 生 蓝 色 物 质 。 用 于 蓝 白 斑 筛 选 的 载 体 具 有 一 段 称 为 lacz的 基 因 ， lacz中 包 括 ： 一 段 -半 乳 糖 苷 酶 的 启 动 子 ； 编 码 肽 链
3、 的 区 段 ； 一 个 多 克 隆 位 点 (MCS)。 MCS 位 于 编 码 肽 链 的 区 段 中 ， 是 外 源 DNA 的 选 择 性 插 入 位 点 。 虽 然 上 述 缺 陷 株 基 因 组 无 法 单 独 编 码 有 活 性 的 -半 乳 糖 苷 酶 ， 但 当 菌 体 中 含 有 带 lacz的 质 粒 后 ， 质 粒 lacz基 因 编 码 的 肽 链 和 菌 株 基 因 组 表 达 的 N 端 缺 陷 的 -半 乳 糖 苷 酶 突 变 体 互 补 ， 具 有 与 完 整 -半 乳 糖 苷 酶 相 同 的 作 用 X-gal 生 成 蓝 色 物 质 的 能 力 ， 这 种
4、 现 象 即 -互 补 。 操 作 中 ， 添 加 IPTG(异 丙 基 硫 代 - -D-半 乳 糖 苷 )以 激 活 lacz中 的 -半 乳 糖 苷 酶 的 启 动 子 ， 在 含 有 X-gal 的 固 体 平 板 培 养 基 中 菌 落 呈 现 蓝 色 。 以 上 是 携 带 空 载 体 的 菌 株 产 生 的 表 型 。 当 外 源 DNA（ 即 目 的 片 段 ） 与 含 lacz的 载 体 连 接 时 ， 会 插 入 进 MCS， 使 肽 链 读 码 框 破 坏 ， 这 种 重 组 质 粒 不 再 表 达 肽 链 ， 将 它 导 入 宿 主 缺 陷 菌 株 则 无 互 补 作
5、用 ， 不 产 生 活 性 -半 乳 糖 苷 酶 ， 即 不 可 分 解 培 养 基 中 的 X-gal 产 生 蓝 色 ， 培 养 表 型 即 呈 现 白 色 菌 落 。 实 验 中 ， 通 常 蓝 白 筛 选 是 与 抗 性 筛 选 一 同 使 用 的 。 含 X-gal 的 平 板 培 养 基 中 同 时 含 有 一 种 或 多 种 载 体 所 携 带 抗 性 相 对 应 的 抗 生 素 ， 这 样 ， 一 次 筛 选 可 以 判 断 出 ： 未 转 化 的 菌 不 具 有 抗 性 ， 不 生 长 ； 转 化 了 空 载 体 ， 即 未 重 组 质 粒 的 菌 ， 长 成 蓝 色 菌 落
6、 ； 转 化 了 重 组 质 粒 的 菌 ， 即 目 的 重 组 菌 ， 长 成 白 色 菌 落 。 X-gal 只是半乳糖苷酶的作用底物,底物的量没有一个确定的值，只要底物的浓度足够显色 就可以了，一般在培养基里，X-gal 的终浓度是 40ug/ml，IPTG 的终浓度是 24ug/ml，就可 以显色，我们把这些直接涂在表面上，就更容易显色了，再多就有点浪费了 天使托 (站内联系 TA) 直接往培养基中添加或者涂布的时候涂布也可以。 。 。 lanbos (站内联系 TA) 在培养基里，我们课题组 X-gal 的终浓度是 30-50ug/ml，IPTG 的终浓度是 0.8-1mM/ml，就
7、 是 1ml 培养基里加 1 微升 IPTG。就可以显色. beautybanana (站内联系 TA) IPTG 的浓度为 24mg/ml，x-gel 的浓度为 20mg/ml，倒到平板后，直接加 IPTG 10ul 和 x-gel 20ul 涂抹均匀 避光保存，或者是 1L 的培养基里（高压灭菌冷却至 60 度，或是灭菌 好的放在冰箱里的培养基加热溶化再冷却至用手摸着感觉不烫了）再加 1ml IPTG 和 2ml x- gel，混匀后倒平板，避光保存（放在超净台上用干净的报纸遮挡起来）就可以了。 以下是我做菌液扩大培养的方法，希望对你能有帮助： 整个操作都在超净工作台中进行，超净工作台预先
8、紫外灭菌 15 分钟。将 长有蓝白斑的平板及灭过菌的菌液培养管放入超净工作台中，向每个培养管加 入 3ul 的 Amp 及 3ml 的 LB 液体培养基（若 LB 培养基中已加 Amp，则可直接加 入管中）。用白枪头挑取白斑后直接打入培养管中，每个样品挑 5 个斑，尽量 挑长在平板中间的、周围有蓝斑生长的的白斑，尽量避免挑的是假阳性。培养 管盖盖前用酒精灯撩一下再盖盖。放入培养箱中过夜（大概 16h),37 度，200 转. 一、 1、蓝白筛选的原理 LacZ是 lacZ 基因的突变型，编码半乳糖苷酶 N 端的 146 个氨基酸（全长 1201 氨基酸） 。 MCS 也在这个区域内。这类载体的
9、适合宿主细胞必须是 Z 基因突变型，只具有 Z 基因 C 端的序列。当两个 Z 基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称 互补。 如 pUC 系列的载体一般采用 DH5、JM109。因为 pUC 系列的质粒具有 lacZ 的 片段， 而具有 lacZM15 基因型的 DH5、JM109 等能表达与 片段互补的 片段，因此当不带 有外源基因的质粒 pUC 导入宿主细胞，具有 lacZ 的 -半乳糖苷酶活性，而插入外源基因 的 pUC 质粒导入宿主细胞，则不具有 -半乳糖苷酶活性。 当将具有 互补的细菌培养在含 IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）及 X-gal（5-溴-4- 氯 -3-吲哚
10、-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因 -半乳糖苷酶能将 X-gal 底物水解产 生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的 5-溴-4- 氯靛兰） ，因此菌落为兰色。相反， 不互补则产生白色菌落。如果在 MCS 位点上插入 DNA 片段导致插入突变，则不能产生 互补，因此菌落是白色的。 从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大 肠杆菌。 2、影响转化率的几个重要因素 、受体细胞 转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶 的突变株，它可容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。 另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。 此
11、外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过多次转接或储存于 4的培养 菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。 、载体 DNA 和重组 DNA 方面 载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体 DNA 转化同一受体细胞，其转化效率不 同。载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外 酶切连接操作后的载体 DNA 或重组 DNA 由于空间上难以恢复，其转化率常比 cccDNA 低 两个数量级。对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。 、操作方面 感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组 DNA
12、 分子 不敏感，难以转化成功。为防止杂菌和杂 DNA 的污染，整个操作均应在无菌条件下进行， 所有器皿最好是新的，并经高压灭菌处理，所有试剂也都要灭菌处理。 、转化体系中重组 DNA 的浓度与纯度 转化体系中重组 DNA 的浓度与纯度对转化率也有一定影响。在一定浓度范围内，浓度 越高，转化率越高，重组 DNA 纯度越高，转化率越高。 、外源基因与宿主染色体的同源性 外源基因来源与宿主亲缘关系越近，越易整合到宿主染色体中，转化率越高，否则易被 宿主核酸酶降解而降低转化率。 二、实验试剂 X-gal： 2%母液（用二甲基甲酰胺配制，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，-20保存 备用） ，工作浓度
13、20ul/20ml 平板； 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成 100mg/ml 母液，置-20冰箱保存。工作浓度 100ug/ml； IPTG：母液 100mmol/L，-20冰箱保存。工作浓度 40ul/20ml 平板； LB 液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl ，用 NaOH 调 pH 到 7.2，121 灭菌 20min 备用。固体 LB 培养基则在 LB 液体培养基中添加 1.5%2% 琼脂，灭菌后备用； 含 Amp 的 LB 固体培养基：将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至 60左右，加 入 Amp 储存液，使终浓度为 100ug/ml，摇匀后铺板；
14、大肠杆菌 DH5a。 试剂的作用： X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）：一种人工化学合成的半乳糖苷，可被 半乳糖 苷酶水解产生兰色化合物。 IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，很强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，它可诱导 LacZ 的表达。 三、实验器具 超净工作台；恒温水浴锅；制冰机；微量移液器；恒温摇床；常温离心机；恒温生化培养 箱；冰箱；培养皿；玻璃刮铲。 四、实验步骤 、取 4ul 连接产物加入 100ul 感受态细胞中，用枪轻轻吹打均匀，冰浴 30min。 、将管置于水浴锅中 42水浴热激 90sec，立刻放置冰上 5min。 、加入 1ml 37预热的 LB 培养基，混匀
15、。 、将管置于恒温摇床上 37振荡培养 1h。 、将管置于离心机中 3000rpm 离心 5min。 、弃 1ml 上清，余下约 100ul 上清，用枪轻轻吹匀，用于涂板。 、在一含氨苄青霉素的 LB 平板上，加入 20l 20mg/ml X-gal 和 40l100mmol/L IPTG。 、将玻璃刮铲过火灭菌后伸入培养平板中，待其冷却后均匀涂布平板，玻璃刮铲过火 灭菌后置于酒精中备用，平板于室温放置 30min 备用。 、将前述所得含重组子的菌液吸至制备好的含 X-gal 的平板上，用玻璃刮铲均匀涂布。 将平板置于生化培养箱中正面放置 30min 后，再倒置，于 37培养过夜。 五、注意事
16、项 1、质粒的质量和浓度 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转化效率与外源 DNA 的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一 般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 10。 2、防止杂菌和杂 DNA 的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的，并经 高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染， 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 3、显色反应的时间 需要将平板放入 4冰箱中 3-4h，使得显色反应充分。 4、平板的涂布 菌液涂平板的时候要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转 化效率。 附件中包含有：整个过程的步骤的图片、一些常见问题与对策 中包含有：整个过程的步骤的图片、一些常见问题与对策 常见问题与对策.doc
