1、组蛋白 H2AX 与 DNA 损伤的分子感应 王会平(综述)，周平坤( 审校) (军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850) 【摘要】 DNA双链断裂是电离辐射对 DNA的重要损伤类型，与细胞死亡、基因突变甚 至细胞恶性转化有密切联系。DNA 发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋 白 H2AX的 C末端丝氨酸残基发生磷酸化，形成 -H2AX。磷酸化的 -H2AX 快速转导 DNA 损伤信号，导致下游分子磷酸化的激活，引发一系列的生物级联反应和和细胞学反应。- H2AX是迄今所研究的最重要的 DNA损伤感应分子。 【关键词】 DNA 双链断裂； -H2AX； 信号转导；
2、 电离辐射 中图分类号： Q512.7 文献标识码： A 文章编号： 1004616X(2006) 04033403 组蛋白是真核细胞特有的蛋白质，是染色质的主要组分之一。它包括 H1、H2A、H2B、H3 和 H4五类，其中 H2A、H2B、H3 和 H4各两分子构成组蛋白八聚体，以 146个碱基对为一单元的 DNA片断缠绕组蛋白八聚体 1.75圈形成核小体的核心颗粒，H1 位 于 DNA进出核心颗粒的结合处。 最近研究发现，DNA 损伤后核心组蛋白的化学修饰能引起染色质结构的改变，从而促 进 DNA的修复。组蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化，在大量细胞核事件尤其是转录调控中 发挥广泛作用。如组
3、蛋白 H3和组蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferase, HAT)突变体 HAT1通过 Asf1p依赖的染色质重构影响 DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)的修复 1；组蛋白 H4的乙酰化也影响了细胞 DSB的修复活性2；组蛋白 H2A除参与了 DNA修复， 还参与了细胞减数分裂和细胞凋亡等过程3。组蛋白 H2A家族包括 H2A1、H2A2、H2AZ 和 H2AX，其中 H2AX在 H2A中含量很少，但在 DNA损伤信号的分子感应和染色质代谢中发挥至 关重要的作用4。我们就近年来组蛋白 H2AX的研究进展作一综述。 1 H2AX 的基本生物
4、学特性 H2AX 基因是在 80年代被克隆的，H2AX 是组蛋白 H2A家族的成员之一，与组蛋白 H2A 家族的其它成员相比，其 C末端区更长，且含有一个进化上高度保守的 C末端基因序列。 从酵母到人类，该 C末端进化上高度保守的基因序列是以丝氨酸为关键的 4个氨基酸残基 组成 SQ(E, D)。这种高度进化保守性提示 H2AX C末端的基因序列可能有重要功能5。目 前，在动物、植物、真菌类，多种原生生物如贾第鞭毛虫的进化中，都发现含有 H2AX同源 物。在啤酒酵母和非洲酒酵母中，完整的 H2A家族由三个基因组成，两个 H2AX同源物和一 个 H2AZ。四膜虫的 H2A家族也有三个基因，除了一
5、个 H2AX基因和一个 H2AZ同源物外还有 一个基因编码 H2A1同源物。H2AX 的 C末端残基是疏水性的，其 SQ基因序列后都有一个酸 性氨基酸残基。而 H2AX的球部与 C末端的距离随进化过程增加，如哺乳动物要比贾第鞭毛 虫长 16个碱基。 那么该高度保守的 SQ基因序列究竟有何重要的功能？重要发现是：当外源性(如电离 辐射，类放射性复合物)和内源性因素使细胞和动物体内的染色质 DNA发生双链断裂时，该 基序中第 139位丝氨酸残基被快速磷酸化形成 -H2AX5。 2 DNA 双链断裂与 H2AX快速磷酸化 无论是在高等的哺乳动物，还是低等的爪蟾、果蝇和酵母中，当电离辐射和其它因素 使
6、 DNA发生双链断裂时，H2A C末端 SQ基因序列均发生磷酸化，且磷酸化在 DSBs产生后 1 min开始出现，10 min达到高峰。针对磷酸化的 H2AX C末端多肽的特异性抗体显示，- H2AX分子在间期核呈不连续的点状分布，在中期染色体呈带状，且带中所含免疫结合位点 的数量与 DNA双链断裂点的数量接近。随着 DSBs被逐渐修复，-H2AX 发生去磷酸化(半 衰期约为 2 h)，与 DNA双链断裂的修复动力学相似。 在哺乳动物细胞中，每产生一个 DSB约有 0.03 的 H2AX磷酸化，相当于 H2AX随机 分布于 2 Mb 染色质区域，然而免疫细胞化学分析提示，这一区域比实际形成点的
7、区域大 10倍，说明并不是每一邻近的 H2AX分子均会发生磷酸化5。 2.1 外界因素诱发 DNA DSBs与 -H2AX 形成 -H2AX 的形成实际上是细胞内一个快速敏感的 DNA损伤信号分子感应，当环境、代 谢等因素使细胞内的染色质 DNA发生双链断裂时，SQ 基因序列的 139位丝氨酸残基快速发 生磷酸化形成 -H2AX。 用脉冲微束激光使细胞特定区域的 DNA发生双链断裂，在这些位置出现 -H2AX 点。 而培养的细胞在有丝分裂时受非致死剂量的电离辐射后，其染色体臂和已断裂的染色体臂 -H2AX 由点状变为带状结构，且在辐射后 30 min即使 DSBs还存在，这一带状结构也不 再扩
8、展。同样用微束激光处理单个细胞产生的 -H2AX 位点与激光路径一致，而且与 Cy3- dCTP荧光标记的 DNA DSBs末端图像径迹完全吻合6。 在羟基脲和紫外线作用下，培养的 S期细胞形成 -H2AX 大大高于 G1/G2/M期细胞， 这种 S期高 -H2AX 产率被认为是 DNA复制叉破坏产生 DSB的缘故7。而受到电离辐射作 用的细胞，无论处于细胞周期那个阶段都能形成 -H2AX。研究表明，细胞在羟基脲或紫 外线作用后，-H2AX 的产生依赖于 ATM(Ataxiatelangiec- tasia-mutatedgene, ATM)和 Rad3相关蛋白 ATR(ATM and Rad
9、3 related protein, ATR)， 但共济失调毛细血管扩张症突变基因缺陷不影响这两种因素所致 -H2AX 的产生。电离辐 射恰恰相反，它诱发细胞形成 -H2AX 是依赖于 ATM的功能而与 ATR的功能无 关8。 ATM敲除的鼠细胞系 -H2AX 形成出现严重障碍。当 ATM敲除细胞系转染 ATM基因后，经 电离辐射后形成 -H2AX。在体外对细胞提取物 ATM做免疫沉淀发现结合有 -H2AX，且从 照射过的细胞提取的 ATM免疫共沉淀物中 -H2AX 形成要更加活 跃9。当 DNA发生双 链断裂后，细胞核中 ATM部分残留在 -H2AX 位点10，10 min后，残留的 ATM
10、和 - H2AX点都能看见，30 min密度最大，1 h后较弱11,12，说明电离辐射后 -H2AX 的形 成主要与 ATM有关。 影响电离辐射后细胞形成 -H2AX 的另一个激酶就是 DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA dependent protein kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)。人类星形胶质瘤细胞系 M059J无 DNA-PKcs活性，受照射后 -H2AX 形成有部分缺失。磷脂酰肌醇(-3)激酶 (Phosphatidylinositol 3 kinase, PI-3K)抑制剂 wortmannin对 -H2AX 位点和 DNA修复 蛋白形成的
11、斑点有明显的抑制作用，而照射 5 min后加入则无效，表明 -H2AX 对其它 因子聚集到 DNA损伤部位是必需的。通过对 ATR和 DNA-PKcs缺陷细胞受电离辐射后 H2AX 磷酸化的动力学研究发现，ATR 和 DNA-PKcs在磷酸化过程中起互补作用13。 2.2 细胞自身代谢产生的 DNA DSBs与 -H2AX 形成 除了环境因素引起 DNA双链断裂外，真核细胞也会产生一些重要的生理性 DNA断裂， 如在哺乳动物免疫系统发育过程中 DNA的 V(D)J重排和细胞减数分裂过程的重组等细胞的 凋亡过程都证实有 -H2AX 形成。 在哺乳动物免疫系统发育过程中，不同区域的基因组库通过 V
12、(D)J重组在机体形成各 种不同的淋巴细胞群。这一过程包括从产生 DNA双链断裂到 DNA片段移位及 DNA重新连接 形成有功能的基因。V(D)J 位点特异性 DNA荧光素原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)探针检测发现，-H2AX 在 V(D)J重组位点出现14。 在细胞第一次减数分裂期的偶线期，同源染色体发生同源联会，而在细胞减数分裂粗 线期，DNA 重组由 Spo11依赖的 DSB启动，并与 -H2AX 的形成有关。早期重组以依赖于 联会的方式进行，是因为 -H2AX 的消除无论在时间和空间上都与联会有关，即使这种联 会是非同源的。
13、H2AX/雄性小鼠由于不能处理在减数分裂的粗线期发生的 DNA双链断裂 而不育15，而 H2AX/细胞与 H2AX/细胞相比，由同源重组引起的靶向性表型细胞 的数量要降低 1020 倍16。 2.3 -H2AX 与 DNA DSBs修复 在细胞和生物体中，H2AX/纯合子细胞对 DNA DSBs的诱发因素如电离辐射和类放 射药物高度敏感。H2AX/细胞系在自发和电离辐射诱导的异常中期染色体如染色体断裂、 融合、交换、大范围的核碎裂等方面也要比正常细胞系高 210 倍16，表明 -H2AX 与 DNA修复密切关联。 哺乳动物组蛋白 H2AX的 C末端区和酵母的 H2AX含一致的 PI-3K位点，
14、在 DSB后快速 发生磷酸化形成 -H2AX5，并快速形成核小点，这些核小点包括有重要 DNA修复蛋白 Nbs1，Rad51 和 Brcal117。非同源末端连接(Nonhomoguous end joining, NHEJ)是 DSBs 的重要修复途径，用抗 -H2AX 抗体标记表明，在 DNA连接后 -H2AX 仍存在，表明在细 胞学能观察到末端连接并不意味着断裂 DNA的修复在分子水平上是完全的18。 当各种因素引起 DNA DSBs时，-H2AX 在断裂位点形成，而作为组蛋白的 H2AX以最 直接的方式或最快的速率与损伤点接触，形成一种结构信号分子，为 PI-3K如 ATM或 ATR
15、提供高亲和位点。PI-3K 激酶分子聚集到断裂位点，又促使该区域 1020的 H2AX发生 磷酸化。ATM 分子能以 -H2AX 一样的速度积累并形成聚集的点。特异抗体检测发现，在 -H2AX 位点有多种 DNA修复蛋白如 BRCA1，Nbs1，53BP1，Rad50 和 Rad5119。 Kobayashi 等20对 DNA修复蛋白在 -H2AX 位点聚集进行了研究，结果发现，Nbs1 与 H2AX之间存在着一种磷酸化依赖的生物物理关系。Nbs1 特殊的 N末端区包含叉状头部区 (Forkhead-associated, FHA)和 BRCA1的 C末端区 BRCT(BRCA1 C-term
16、inal, BRCT)域，这 两个结构域与 Nbs1和 -H2AX 的结合有关。这样，H2AX 磷酸化的丝氨酸和 Nbs1的 FHA/BRCT结构域可能提供了一个新的信号识别分子聚合体。H2AX 锚定在染色质上并标记断 裂位点，移动因子如 53BP1由于与 -H2AX 的 C末端尾部有亲和力或染色质变构聚集到断 裂位点5。 虽然 H2AX缺陷对生命没有威胁，但 H2AX对大量重要蛋白在辐射诱导聚集点(foci)的 形成是必须的。Celeste 等21发现，DSBs 修复蛋白和信号蛋白的移位在 H2AX/细胞 不能被清除，Nbs1 和 Brca1等多种因子虽然最初聚集到 DSBs位点，但终不能形
17、成点。- H2AX并不构成 DSBs修复蛋白重分布于损伤染色质的初始信号，但对断裂 DNA附近的浓集 蛋白起作用。H2AX 的缺失虽然破坏了 Nbs1聚集到修复位点，但并不影响聚集到复制点16。 3 -H2AX 的临床医学意义 Banath 等4通过对 6种人类宫颈癌细胞系的 DNA断裂与修复及 -H2AX 形成与消除 的动力学研究发现，不同的细胞系经电离辐射照射后 -H2AX 的丢失有所差别，其中部分 与细胞系本身的辐射敏感性有关。有辐射抵抗性的肿瘤组织或正常细胞系，在照射后的前 几个小时内，-H2AX 的消失速度要快的多。在辐射敏感的细胞或 C3H鼠分离的正常组织， -H2AX 的消失速度
18、则相对较慢。应用流式细胞术检测培养细胞系、肿瘤细胞和正常组织 DSBs后 -H2AX 的浓度，发现 -H2X 的表达可能为区分辐射敏感的肿瘤组织或正常组织 提供信息22。 Kai 等23发现，在培养的初始成纤维细胞系受很低的辐射剂量(1 mGy)照射时， DSBs很多天都不修复。这与高剂量照射时 DSBs的高效修复形成鲜明对比。而经照射的培 养细胞增值后与未经照射的细胞相比，其 DSBs水平降低，提示这一效应可能是由含不能修 复的 DSBs的细胞的清除引起的。该结果与当前风险评估模型相比显示，在低剂量(1 mGy200 mGy)和高剂量(10 Gy80 Gy)辐照后，其细胞效应是同样有效的，提
19、示 -H2AX 点的形成可能作为人类受低剂量电离辐射后直接的生物学标记。 成胶质细胞瘤是威胁人类生命的脑肿瘤。研究发现，具有辐射抗性的 T98G成胶质细胞 瘤细胞在转入 H2AX后，对辐射和依托泊苷(抗肿瘤药)引起的 DNA损伤敏感性增加。当转入 H2AX的 T98G细胞受电离辐射照射后，Brcal 和 Nbs1聚集到 DSB位点，表现为细胞周期的 G2/M期阻滞，并且照射后的 H2AX-T98G细胞可观察到 Brcal上调。转染 H2AX并不影响在 基因毒性刺激下非肿瘤细胞的生长活性，这表明 H2AX基因的转入可能能克服基因组的不稳 定性，为成胶质细胞瘤的放化疗提供了新的模型，而 Brca1
20、和 Nbs1在这一方法中可能至关 重要24。 组蛋白在 DNA复制、转录、细胞周期和 DNA损伤修复细胞凋亡等细胞事件中发挥着重 要作用。对 H2AX功能研究将有助于我们加深对一些基本细胞活动的认识，为临床应用提供 理论基础。另外，-H2AX 的免疫检测为多种肿瘤和遗传性疾病提供了有效的生物学指标， 从而有助于肿瘤早期诊断和治疗。 动 基 体 （ kinetoplast） 是 在 Trypanosoma 类 及 Bodo 类 存 在 的 具 有 自 身 繁 殖 性 的 细 胞 器 。 最 早 以 细 胞 内 的 嗜 伊 红 性 的 颗 粒 而 记 载 ， 在 鞭 毛 与 基 底 小 体 会 合
21、 的 地 方 存 在 ， 亦 称 副 基 底 小 体 。 它 是 特 化 了 的 线 粒 体 ， 含 动 基 体 DNA（ K DNA） ， 有 时 只 把 含 DNA 的 部 位 称 为 动 基 体 。 K DNA 由 两 种 环 状 DNA 即 小 型 环 状 DNA（ minicir cle） 与 大 型 环 状 DNA（ maxicircle） 组 成 。 小 型 环 状 DNA 数 千 个 分 子 与 少 数 大 型 环 状 DNA 以 连 环 （ catenane） 状 连 接 成 网 （ kinetoplast DNAnetwork） ， 约 占 细 胞 全 DNA 量 之 20
22、 。 小 型 环 状 DNA 占 动 基 体 DNA 的 9597 ， 合 约 2500 个 核 苷 对 、 碱 基 对 多 种 。 而 大 型 环 状 DNA 含 有 4 万 核 苷 对 ， 为 具 有 同 一 碱 基 排 列 顺 序 的 DNA 群 。 大 型 环 状 DNA 一 般 认 为 相 当 于 通 常 的 线 粒 体 DNA。 拓扑异构酶（topoisomerase） 是指通过切断 DNA 的一条或两条链中的磷酸二酯键， 然后重新缠绕和封口来更正 DNA 连环数的酶。拓扑异构酶、通过切断 DNA 中的一条链 减少负超螺旋，增加一个连环数。某些拓扑异构酶也称为 DNA 促旋酶。 D
23、NA 拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化 DNA 链的断裂和结合， 从而控制 DNA 的拓扑状态。近来的研究表明，在 RNA 转录过程中，拓扑异构酶参与了超 螺旋结构模板的调节。主要存在两种哺乳动物拓扑异构酶。DNA 拓扑异构酶 I 通过形成短 暂的单链裂解-结合循环，催化 DNA 复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶 II 通 过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变 DNA 的拓扑状态。哺乳动物拓 扑异构酶 II 又可以分为 II 型和 II 型。拓扑异构酶毒素类药物的抗肿瘤活性与其对酶- DNA 可分裂复合物的稳定性相关。这类药物通过稳定酶-DNA 可分裂复
24、合物，有效地将酶 转换成纤维毒素。 临床使用的几种抗肿瘤药物可以作为哺乳动物异构酶 II 型毒素。这些药物包括阿霉 素（adriamycin ） 、放线霉素 D（actinomycinD） 、道诺梅素（ daunomycin） 、VP-16 、VM- 26（替尼泊苷 teniposide 或者表鬼臼毒素（epipodophyllotoxin） 。相对来说，无论是临床， 还是处在试验阶段的，作为哺乳动物异构酶 II 型毒素的药物较多，而目前确定可以作为拓 扑异构酶 I 毒素的药物只有极少数。喜树碱（ Camptothecin）及其类似体是研究得最为广泛 的拓扑异构酶 I 型毒素。最近已被确定为拓
25、扑异构酶 I 型的毒素有： 双- 和四苯咪唑 （Chen 等，CancerRes.1993,53,1332-1335;Sun 等,J.Med.Chem.1995,38,3638-3644 ；Kim 等, J.Med.Chem.1996,39,992-998） ，某些白屈菜生物碱（benzocphenanthridine）和原小檗碱类 生物碱（protoberberine）与合成的类似体（Makhey 等，Med.Chem.Res.1995,5,1-12； Janin 等，J.Med.Chem.1975，18，708-713 ；Makhey 等，Bioorg. 27:338-344)(IF 10
26、.372)上发表 了题为 Emerging cancer therapeutic opportunities target DNA-repair systems 的综述性文章，系 统地总结了当前 DNA 修复及 DNA 修复干扰的研究现状，提出了通过 DNA 修复干扰增强 DNA 损伤剂的抗肿瘤疗效、克服肿瘤耐药的构想，揭示出 DNA 修复系统中潜藏的抗肿瘤 治疗新机会。 损伤 DNA 是当前临床治疗肿瘤常用的离子辐射及绝大多数抗癌药物共同的基本分子 机制。不同因素导致的 DNA 损伤可以通过六条既相互依存又相互独立的修复通路予以修 复。DNA 修复能力异常激活和增强是导致肿瘤对 DNA 损伤
27、剂先天性或获得性耐药的重要 分子基础；相反，修复缺陷则使肿瘤对其高敏感。DNA 修复的遗传性缺陷也是多种遗传性 疾病的分子基础，这些患者常常表现出极高的肿瘤易感性。所有这些构成了将干扰 DNA 修复作为一种抗肿瘤辅助治疗措施的基础。目前已有约十种靶向不同 DNA 修复分子的化 合物正在进行不同阶段的临床试验。现有资料显示，O6- 烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶 (AGT)抑制剂和聚 ADP 核糖聚合酶(PARP)抑制剂是两类有希望的抗肿瘤辅助药物。前者与 氯乙基或甲基化烷化剂合用可显著增强后者在多种实体瘤包括结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、 肺癌、胶质瘤的疗效；而后者更为特别的是，其单独使用即可对同
28、源重组修复缺陷(如 BRCA1、BRCA2 缺陷)的肿瘤产生高度选择性杀伤作用。另一特别值得关注的是，由中国 科学院上海药物研究所研发的抗肿瘤新药沙尔威辛可以直接损伤 DNA 并干扰 DNA 非同源 重组修复通路，延缓耐药性的产生，增强治疗效果，开创了同一药物兼具损伤 DNA 和干 扰修复双重作用的范式 DNA 修复（DNA repairing） 一、DNA 的损伤 环境作用 1.物理因素 紫外线：形成嘧啶二聚体，使转录终止，复制受阻。 电离辐射： X- 射线等，主要通过电离作用造成损伤。可造成多种损伤，如 DNA 断裂、碱基脱 落、杂环破裂、氧化等。 2.化学因素 烷化剂：有活泼烷基，可转移
29、到碱基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子 气等。鸟嘌呤的 O6 和 N7 最易烷化，导致错配(GT)或脱落。磷酸三酯不稳定，易断裂。双 功能试剂可造成交联。 碱基或核苷类似物：FU、BrdU、6- 巯基嘌呤等。可竞争抑制 核苷酸合成或掺入核酸导致错配。 亚硝酸盐及亚硝胺：前者造成脱氨，后者氧化后生 成烷化剂和自由基。 代谢活化化合物：如苯并笓、黄曲霉毒素等。经混合功能氧化酶 催化形成环氧化物，与核酸结合，造成突变。以上物理及化学因素统称诱变剂。 3.生物因素 DNA、RNA 肿瘤病毒可插入基因组，引起突变。 自发性损伤 1.复制时的碱基错配 2.互变异构：A=NH 时可形成 A=C，G OH 时可形
30、成 GT 三键配对 3.碱基脱氨：C-U，A-I，G-X 4.碱基丢失：大肠杆菌每代丢失一个嘌呤，哺乳动物可达一万个。嘧啶丢失几率只有 嘌呤的 1/20。 DNA 修复 光修复 这是最早发现的 DNA 修复方式。修复是由细菌中的 DNA 光解酶（photolyase）完成， 此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步 反应不需要光；结合后如受 300-600nm 波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为 两个正常的嘧啶单体，然后酶从 DNA 链上释放，DNA 恢复正常结构。后来发现类似的修 复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。DNA 光解酶可被可
31、见光（300600 纳 米，400 纳米最有效）激活，分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。此酶广泛存在， 但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞，且是次要修复方式。 切除修复 （一）细胞内有多种特异的核酸内切酶，可识别 DNA 的损伤部位，在其附近将 DNA 单链 切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶 封口。 （二）碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的 N-糖苷酶切除， 然后用 AP（apurinic/apyrimidinic，缺嘌呤或缺嘧啶）核酸内切酶打开磷酸二酯键，进行切 除修复。DNA 合成时消耗 NADPH 合成胸腺嘧啶，可与胞嘧
32、啶脱氨形成的尿嘧啶相区别， 提高复制的忠实性。RNA 是不修复的，所以采用“廉价”的尿嘧啶。 （三）切除修 复不需光照，也称暗修复。大肠杆菌中有 UvrABC 系统，可切除修复嘧啶二聚体。人体缺 乏相应系统则发生“着色性干皮病” ，皮肤干燥，有色素沉着，易患皮肤癌。可加入 T4 内 切酶治疗。 单链断裂的重接 DNA 单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由 DNA 连接酶（ligase）参与而完全修 复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂缺几乎不能 修复。 碱基的直接插入 DNA 链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被 DNA 嘌呤插入酶（insertase ）识别结
33、合， 在 K+存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有 高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使 DNA 完全恢复。 烷基的转移 在细胞中发现有一种 O6 甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从 DNA 链鸟嘌呤 O6 位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的 DNA。这个酶的修复能力并不很强， 但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。 重组修复 此过程也叫复制后修复。重组修复中原损伤没有除去，但若干代后可逐渐稀释， 消除其影响。所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶，如重组蛋白 A、B、C 及 DNA 聚合酶、连接酶等。 诱导修复 DNA 严重
34、损伤能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应，包括修复效应、诱 变效应、分裂抑制及溶原菌释放噬菌体等。细胞癌变也可能与应急反应有关。应急反应诱 导切除和重组修复酶系，还诱导产生缺乏校对功能的 DNA 聚合酶，加快修复，避免死亡， 但提高了变异率。单链 DNA 诱导重组蛋白 A，可水解 Lex A 蛋白，使一系列基因得到表 达，如 RecA、 UvrABC、SOS 修复所需的酶等，产生应急反应。应急反应可作为致癌物的 简易检测方法。采用缺乏修复系统、膜透性高的 E.coli 突变株，并添加鼠肝匀浆液。 Ada 蛋白 也叫适应性蛋白，可识别甲基化的 DNA，将甲基转移到自身的半胱氨酸上，不可 逆，
35、故称“自杀修复” 。可修复磷酸及鸟苷上的甲基。 真核细胞修复特点 1. 多聚腺苷酸核糖化：由多聚(ADP- 核糖) 聚合酶催化，用 NAD 合成并转移到相 应蛋白上。可增加一些修复酶的活性，如连接酶。 2. 转录修复偶联：转录时，若 模板链损伤，则转录暂停，转录因子 TFIIS 使聚合酶退回，CSA/CSB 及 TFIIE 召集修复。 若 DNA 双链损伤，则模板链优先修复。 E.coli 中存在 4 种基本的 DNA 修复系统：直接修复（direct repair） ，核苷酸切除修复 （excision repair） 、碱基切除修复（base excision repair）和错配修复（m
36、ismatch repair） 。 直接修复（direct repair） 是通过一种可连续扫描 DNA，识别出损伤部位的蛋白质，将损伤部位直接修复的 方法。该修复方法不用切断 DNA 或切除碱基。 一些蛋白质可以识别和修复某种损伤 的核苷酸和错配的碱基，这些蛋白可以连续监测 DNA。胸腺嘧啶二聚体就可以通过直接修 复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的。在所有原核生物和真核生物中都存在 一种光激活酶（photoreactivating enzyme） ，在可见光存在下，这种酶可以结合胸腺嘧啶二 聚体引起的扭曲双螺旋部位，催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的 A-T 碱基对重新形成， 然后光
37、复活酶从已修复好的 DNA 上脱落。核苷酸切除修复（nucleotideexcision repair） 通过切除- 修复内切酶使 DNA 损伤消除的修复方法。一般是切除损伤区，然后在 DNA 聚 合酶的作用下，以露出的单链为模板合成新的互补链，最后用连接酶将缺口连接起来。 形成胸腺嘧啶二聚体会引起 DNA 双螺旋结构的变形，这样的损伤也可以通过核苷酸切除 系统修复。修复系统中的主要酶 ABC 切除核酸酶。给出了 ABC 切除核酸酶修复 DNA 损 伤的过程。首先 ABC 切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的 DNA 链。然后，解旋 酶除去内切酶切点之间的 DNA 片段，有时 DNA 片段
38、由外切酶降解，产生单链缺口。然后 在 DNA 聚合酶的催化下按照互补链填充缺口，切口最后通过 DNA 连接酶连接。 碱基切除修复 DNA（baseexcision repair） 糖基化酶（DNA glycosylases）能识别 DNA 中的不正确碱基，如尿嘧啶、次黄嘌呤 和黄嘌呤，这些碱基是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤脱氨形成的。DNA 糖基化酶可以切断这 种碱基 N-糖苷键，将其除去，形成的脱嘌呤或脱嘧啶部位通常称为“abasic“ 部位或 AP 位点。 然后由 AP 内切核酸酶（AP endonucleases）切去含有 AP 位点的脱氧核糖-5-磷酸，在 DNA 聚合酶作用下重新放置一个
39、正确的核苷酸，最后通过 DNA 连接酶将切口封闭。每种 DNA 糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。 错配修复（mismatch repair） 在含有错配碱基的 DNA 分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。这种修复方 式的过程是：识别出不正确的链，切除掉不正确链的部分，然后通过 DNA 聚合酶和 DNA 连接酶的作用，合成正确配对的双链 DNA。 错误的 DNA 复制会导致新合成的链与 模板链之间的产生错误的碱基配对。这样的错误可以通过 E.coli 中的 3 个蛋白质 （MutS 、MutH 和 MutL）校正。该修复系统只校正新合成的 DNA，因为新合成 DNA 链的 GATC 序
40、列中的 A（腺苷酸残基）开始未被甲基化。GATC 中 A 甲基化与否常用来区别新 合成的链（未甲基化）和模板链（甲基化） 。这一区别很重要，因为修复酶需要识别两个核 苷酸残基中的哪一个是错配的，否则如果将正确的核苷酸除去就会导致突变。(右图) 说明 了 MutS、MutH 和 MutL 三种蛋白质是如何校正新合成 DNA 中的一个错配错误的。未甲 基化的 GATC 序列不需要紧靠着错配碱基，因为错配碱基与 GATC 序列之间的间隔的 DNA 序列可以被外切核酸酶切除，是从 3还是从 5方向切除取决于不正确碱基的相对 位置。 ATM 激活的新模型 当细胞的 DNA 受损伤时，细胞内会启动损伤修复
41、机制。ATM(ataxia- telangiectasia， mutated)激酶在细胞遭受离子辐射后会启动信号传导途径。关于这个途径被 激活的确切机制还并不清楚，Christopher Bakkenist and Michael Kastan 在 Nature 上发表的 新研究探讨了 ATM 是怎样被激活的。 ATM 蛋白属于 PI3K（phosphoinositide 3-kinase）蛋白家族，作用于蛋白质而非脂 类。被转化的 ATM 是磷酸化的蛋白，如果其活性被翻译后修饰进行调控的话，这些问题 就容易理解了。研究者发现 ATM 在一个特殊的位点 1981 位丝氨酸上被磷酸化。特异性的
42、抗体显示 Ser1981 在细胞被离子辐射处理后被磷酸化。而且激酶结构域缺失的 ATM 转化 入细胞被磷酸化依赖于具有活性激酶结构域的 ATM，说明 ATM 的自身磷酸化是反式作用 的。 为了研究这个磷酸化究竟具有什么功能，研究者用 GST 标记蛋白来进行分析发现 激酶能够被磷酸化的结构域相互结合，Ser1981 周围的位点也是非常重要的。这个相互作 用可以自身结合，也可以进行分子间的反式结合。研究者用甲醛交连的实验研究 ATM 是 否能够通过此作用形成高级的多体复合物。他们发现包含 ATM 的复合物能够缓慢的向变 性的 ATM 单体形式转变，但离子辐射处理后的细胞不会发生这种转变，转变后的
43、ATM 单 体丝氨酸也不再被磷酸化。 研究者接着用 293T 细胞发现 ATM 确实能够对离子辐射产生形成高级复合物的反 应，这是依赖于丝氨酸被磷酸化的。 这个模型第一次提出了 ATM 被激活的可能模式。但是对于 DNA 损伤究竟怎样作 用于 ATM 还并不清楚，需要今后的深入研究。 MG-132(Proteasome 抑制剂 )，也称 Z-LLL-CHO，Z-Leu-Leu-Leu-CHO，Z-Leu-Leu- Leu-al 或 Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal，是一种常用的 Proteasome 抑制剂，即 蛋白酶体抑制剂。MG-132 可
44、以通透细胞，选择性抑制 Proteasome，Ki4nM。可以激活 JNK1 并抑制 NF-B 的激活 (IC50=3M) 。在 10M 时可以诱导 PC12 细胞产生 neurite outgrowth。 MG132 主要是通过抑制 proteasome-dependent degradation pathway 来抑制蛋白的降解， 但也会抑制少许丝氨酸蛋白酶。 泛素蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway) 介导的蛋白降解是机体调节细胞内 蛋白水平与功能的一个重要机制。负责执行这个调控过程的组成成分包括泛素及其启动酶 系统和蛋白酶体系统。泛素启动酶系统负责活化
45、泛素，并将其结合到待降解的蛋白上，形 成靶蛋白多聚泛素链，即泛素化。蛋白酶体系统可以识别已泛素化的蛋白并将其降解。此 外，细胞内还有另一类解离泛素链分子的去泛素化蛋白酶形成反向调节 DMSO 定义： 无色液体，重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。一种氢键破坏剂。因 其抗冻作用，可用于细胞的冻存；因其对大分子的变性作用，用于变性凝胶电泳等。二甲 基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明 液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶 的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”
46、DMSO 也 是 一 种 渗 透 性 保 护 剂 ， 能 够 降 低 细 胞 冰 点 ， 减 少 冰 晶 的 形 成 ， 减 轻 自 由 基 对 细 胞 损 害 ， 改 变 生 物 膜 对 电 解 质 、 药 物 、 毒 物 和 代 谢 产 物 的 通 透 性 。 但 研 究 表 明 ， DMSO 存 在 一 定 的 毒 性 作 用 ， 与 蛋 白 质 疏 水 集 团 发 生 作 用 ， 导 致 蛋 白 质 变 性 ， 具 有 血 管 毒 性 和 肝 肾 毒 性 。 DMSO 对 许 多 药 物 具 有 溶 液 性 、 渗 透 性 、 本 身 具 有 消 炎 、 止 痛 ， 促 进 血 液 循
47、 环 和 伤 口 愈 合 ， 并 有 利 尿 、 销 静 作 用 。 能 增 加 药 物 吸 收 和 提 高 疗 效 ， 因 此 在 国 外 叫 做 “万 能 药 ”。 各 种 药 物 溶 解 在 DMSO 中 ， 不 用 口 服 和 注 射 ， 涂 在 皮 肤 上 就 能 渗 入 体 内 ， 开 辟 了 给 药 新 途 径 。 更 重 要 的 是 提 高 了 病 区 局 部 药 物 含 量 ， 降 低 身 体 其 他 的 药 物 危 害 碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)即 2,7-二氨基-9-苯基 10-二乙胺基丙基碘化菲啶，是一 种核酸荧光染料，它不能透过完整的细胞膜，但
48、能够透过死细胞和凋亡中晚期细胞的细胞 膜而使细胞核红染。因此，作为荧光探针常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的 检测。在流式细胞和激光共聚焦分析中，常用于凋亡早晚期的细胞以及死细胞的区分以及 在免疫染色时用于死细胞的非特异性染色的减除。由于 PI 可以定量插入 DNA 中，因此， 还可用于细胞周期的分析与测定研究。 c-Jun is the name of a gene and protein that, in combination with c-Fos, forms the AP-1 early response transcription factor.
49、It was first identified as the Fos-binding protein p39 and only later rediscovered as the product of the c-jun gene. It is activated through double phosphorylation by the JNK pathway but has also a phosphorylation-independent function. c-Jun knockout is lethal, but transgenic animals with a mutated c-Jun that cannot be phosphorylated (termed c-JunAA) can survive. A recent study was carried out to evalua
