1、河北科技大学 工程硕士专业学位论文开题报告 课题名称：利普司他汀提取工艺及杂质的研究 姓 名: - 入学时间： 2015 年 9 月 工程领域: 生物工程 所属学院: 生物科学与工程 学校导师: - 企业导师: - 说 明 一、工程硕士专业学位研究生开题报告各项内容，要客观实际，逐条认真 填写。表达要明确、严谨，外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现缩写 词，须注出全称。 二、开题报告评议组由教授或具有硕士研究生指导教师资格的副教授组成， 评议组成员一般不得少于五人，其中至少应有一位企业人员，并设一位组长。 设记录员一位。 三、题报告结束后，由评议组成员综合评议意见，写出具体评议结论。并 由
2、领域负责人审核签字后，报研究生学院备案。 四、根据论文工作的最终研究结果，研究生所提交学位论文的题目可以在 本开题报告的基础上有适当改动。 五、本开题报告一式四份，校内导师、校外导师各一份，领域留一份，交 研究生学院学位办一份备案（除签字部分外必须按 A4 纸打印） ，研究生学院不 负责查询。 河北科技大学 工程硕士专业学位论文开题报告评审表 姓名 陈敏 学校导师 刘俊果 企业导师 李小兵 工程领域 生物工程 开题时间 2016、06、30 第 1 次开题 题目名称 利普司他汀提取工艺及杂质的研究 性质（） 工程设计（ ） ；技术研究（） ；应用软件（ ） ；工程管理（ ） 论 文 选 题 项
3、目来源（） 企业项目（） ； 部（省）项目（ ） ； 国家项目（ ） ；校企联合项目（ ） ； 自拟项目（ ） 。 姓 名 职 称 工作单位及职务 签字 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 评 审 组 成 员 - 教授 河北科技大学 评 审 意 见 （含：选题意义；实验条件；技术方案可行性；研究计划合理性等） 成 绩 评审组长签字： 年 月 日 领域负责人签字： 年 月 日 注：1、成绩以“合格” “不合格”记；评审组成员为高级职称人员。 2、工程设计类包括：工程设计、建筑设计、产品设计
4、、工艺设计、工业设计等； 技术研究类包括：应用基础研究、应用研究、预先研究、实验研究、系统研究等； 应用软件类包括：系统软件、应用软件、数据库、网络等； 工程管理类包括：工程管理、工程规划等 1、立论依据（所选课题的科学意义和应用前景，国内外研究现状分析，主要参考文献目录）： 1、课题的科学意义和应用前景 利普司他汀（Lipstatin) 作为脂肪酶抑制剂，是毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)的次级代谢 产物，能选择性抑制胃肠道中脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收，结构式如图所示，其四氢衍 生物奥利司他（Orlistat)已被罗氏公司成功地开发为消化吸收阻滞型减肥
5、药物，是目前唯一一个作为 非中枢神经系统治疗肥胖症的药物，在为人们减轻体重的同时能有效的改善由肥胖症给人们带来的 心血管等疾病的困扰，使其治疗有更好的安全性和耐受性。因此利普司他汀的研究具有广阔的应用 前景和重要的科学意义。 利普司他汀（Lipstatin)结构式 2、国内外研究现状分析 （1）对胰脂肪酶抑制剂的研究 1980 年夏天,罗氏公司的科研人员采集到土壤样本；1981 年 4 月,他们从 3165 个发酵罐中发现 了 1200 株对胰脂肪酶有抑制作用的微生物,并且其中有一株微生物所产生的物质具有最大的活性和 稳定性；1982 年 10 月，利普司他汀（Lipstatin)被分离纯化，
6、结构式被阐明；1993 年 4 月，经过对 利普司他汀（Lipstatin) 的氢化，得到稳定的奥利司他（ Orlistat)，并将其开发成减肥药物赛尼可 （Xenical） ，是一种安全的全新肥胖治疗药物，在美国是唯一的减肥用药，目前占抗肥胖药物全球 销售额的第一位。 （2）利普司他汀（Lipstatin)提取工艺的优化研究 奥利司他（Orlistat)由罗氏公司原研，1999 年被 FDA 批准上市，2007 年被 FDA 批准为非处方 药（OTC） ，目前占抗肥胖药物全球销售额的第一位，成为首只进入“重磅炸弹”行列的减肥药物。然 而受工艺水平限制，不管是全合成工艺还是通过发酵中间体利普司
7、他汀（Lipstatin)进行制备的半合 成工艺，生产制备收率均不是特别理想，由此直接导致生产成本过高。 李小兵、赵平等人利用反向高效液相色谱制备高纯度奥利司他（Orlistat)，提高产品收率，简 化工艺流程，降低运行成本。 彭平、郭萍等人将利普司他汀（Lipstatin)的有机溶剂萃取液进行浓缩，得到的浓缩物与 C5-C20 烷烃以及液态有机盐混合,过滤,得到滤液，再将滤液进行降温、结晶，得到利普司他汀（Lipstatin)。 克服了现有技术设备成本高、耗能大、操作繁琐、一次处理量小等缺陷,降低了生产成本,提高了生产 效率,适合工业化大生产。 赵志全、刘茂田研究了发酵法生产减肥药奥利司他（
8、Orlistat)的制备新方法，通过发酵浸提液的 大孔吸附树脂层析以及奥利司他（Orlistat)的硅胶柱层析等方法,达到良好的除杂、纯化产品的效果。 武汉奥多生物医药有限公司有一套完整的利普司他汀（Lipstatin)提取工艺，如下提取工艺物料 衡算图所示，将 40 吨发酵液经预处理后进行两次板框过滤，得到的 10 吨湿菌丝体在 75%的乙醇中 进行浸提，浸提液进行大孔树脂吸附，除去含有的葵花油和发酵过程中产生的部分杂质，可得到 56m3 的洗脱液，加入 10m3 的正庚烷进行萃取浓缩，可得到正庚烷浓缩液 660kg，上硅胶柱层析， 进一步除去代谢过程中产生的杂质，将得到的 600kg 硅胶
9、浓缩液进行结晶、过滤，最终得到利 普 司 他 汀 （Lipstatin)成 品 浓 缩 液 195 240kg。 虽 然 该 公 司 的 提 取 纯 化 工 艺 能 使 利 普 司 他 汀 （Lipstatin)的 色 谱 纯 度 达 到 88.0-92.0%， 但 是 在 进 行 大 孔 吸 附 时 每 40 吨 的 发 酵 液 将 产 生 182.6m3 的 废 乙 醇 ， 56m3 的废水，尽管废乙醇可以进行回收再利用，但 运行成本过高，并且易燃易爆，不适合工业化生产，故需进一步改善提取工艺。 在查阅了大量的参考文献和学习了前人的成果后，并对分离提取的实验进行了系统的学习，为 了最大化减
10、少乙醇浪费，适合工业化生产，在原有的基础上将乙醇浸提液直接进行正庚烷萃取、浓 缩，将得到的正庚烷浓缩液加入乙腈在20，冷冻 5-6h 除去葵花油，再进行浓缩，由甲醇溶解上 硅胶柱层析。此工艺的改进在降低生产成本的同时，依旧能达到较高的色谱纯度，为以后的解谱确 定各杂质结构工作打下坚定的基础。 利普司他汀（Lipstatin)提取工艺物料衡算图 发酵液 40 吨 湿菌丝 10 吨 浸泡液 56m3 上柱液 64m3 洗脱液 56m3(废乙醇 103.2m3 废水 56m3) ) 正庚烷萃取液 10m3 (废乙醇 79.4M3) 正庚烷浓缩液 660kg 硅胶上柱液 4m3 硅胶浓缩液 600kg
11、 利普司他汀粗品结晶液约 3.4m3 利普司他汀粗品 250 280kg （废己烷约 3.2m3) 利普司他汀 （Lipstatin)成品 结晶液 2.8m3 利普司他汀成品浓缩液 195 240kg(废己烷约 2.7m3) 3、主要参考文献目录 1 Schuhr CA, Eisenreich W, Goese M, et al. Biosynthetic precursors of the lipase inhibitor lipstatinJ. J Org Chem, 2002, 67(7): 2257-2262. 2 S.多斯沃德，E.库普菲， G.斯坦鲍尔，等.一制胰酯菌素的的提纯方法
12、 P.ZL200510094601.4,2005.09.29 3 Weibel EK,Hadvary P,Hochuli E,et al.Lipstatin,an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producing organism, fermentation, isolation and biological activityJ.J Antibiot (Tokyo),1987,40(8): 1081-1085. 4 李小兵，李思琦，焦彦凯等.高纯度奥利司他的制备与放大J.中国抗生
13、素杂质， 2014,39（3）： 210-213. 5 胡为民. Lipstatin 发酵及提取工艺 D. 上海：华东理工大学生物工程学院，2006. 6 Clarke NJ，indgen D，Korfmacher WA，et al Systematic LC /MS metabolite identification in drug discoveryJ Anal Chem，2001，73(15): 430A 7 AnneB, StevenRP.Orlistat: its currentstatus as an anti-obesity drugJ. Euro J Pharmaco, 200
14、2, 440(1): 109-117. 8 徐勇煌,彭韪,唐彬喜,等.一种奥利司他的制备方法P.CN201110047178.8,2011,02,28. 9 赵志全，刘茂田.一种生产制备奥利司他的方法 P.CN201010505171.1，2010，10，13. 10 Goese M, Eisenreich W, Kupfer E et al. Biosynthesis of lipstatin. Incorporation of multiply deuteriumlabeled (5Z,8Z)-tetradeca-5,8-dienoic acid and octanoic acid. J
15、Org Chem. 2001,66(13):4673-4678. 11 Demirev AV, Khanal A, Sedai BR et al. The role of acyl-coenzyme A carboxylase complex in lipstatin biosynthesis of Streptomyces toxytricini. Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 87(3):1129-1139. 12 谭晓世，王栋海，王晏，等.毒三素链霉菌发酵产物中有关物质的结构鉴定 J.江苏药学 与临床研究，2006,14（3）：176177. 13 朱
16、国荣 ，应雪肖，邓传亮，等一种提纯奥利司他的方法:中国，200910169508.3 P .2009 0908 14 Goese M，Eisenreich W，Kupfer E，et al Biosynthetic origin of hydrogen atoms in the lipase inhibitor lipstatin J .The Journal of Biological Chemistry,2000,275( 28): 21 19221 196 15 Souri E, Jalalizadeh H, Kebriaee-Zadeh A, et al. HPLC analysis
17、of orlistat and its application to drug quality control studiesJ.Chem Pharm Bull( Tokyo),2007,55(2): 251-254. 16 石其德，朱骊安，蒋俊云，等.奥利司他原料药制备过程中的杂质分析J.中国药业， 2013,22 （2）：210-213. 17 Schuhr CA, Eisenreich W, Goese M et al. Biosynthetic precursors of the lipase inhibitor lipstatin. J Org Chem. 2002, 67(7):2
18、257-2262. 18 Sanchez S, Demain AL. Metabolic regulation and overproduction of primary metabolites. Microb Biotechnol. 2008,1(4):283-319. 2、研究内容，预期目标或成果（具体说明课题研究内容，要重点解决的关键问题和本课题所要达到 的目标或要取得的成果）： 1、研究内容： （1）走通新工艺，利普司他汀（Lipstatin)色谱纯度达 88.0%92.0%。 （2）高压制备,分离得到 46 个杂质单体。 （3）对各杂质单体、利普司他汀（Lipstatin)样进行 L
19、C/MS 检测，结合利普司他汀（Lipstatin) 生物合成途径，解谱确定各杂质结构。 （4）根据解谱后的各杂质结构，进一步研究利普司他汀的生物合成途径。 2、重点解决的关键问题： （1）走通新工艺，达到较高的色谱纯度。 （2）结合利普司他汀（Lipstatin)的生物合成途径，进行 LC/MS 检测，解谱确定各杂质结构。 3、预期目标： （1）查阅大量文献了解利普司他汀（Lipstatin)的生物合成途径；走通新工艺使色谱纯度达到 88.0%-92.0%；解谱确定各杂质结构。 （2）发表论文一篇。 3、拟采用的研究方法、技术路线、试验方案、可行性分析及研究进度安排： 研究方法： 1.在原有
20、工艺的基础上去掉大孔树脂吸附，降低成本，增加乙腈除油工艺。 2.高压制备，分离 46 个杂质单体。 3.查阅大量文献，结合利普司他汀（Lipstatin)的生物合成途径，并将利普司他汀样进行 LC/MS 检测，解谱确定各杂质结构。 4.根据杂质结构，进一步研究生物合成途径。 试验方案： 将利普司他汀（Lipstatin)发酵液进行预处理，加入 85%左右的乙醇超声破碎 30min,得到浸提液， 加入正庚烷萃取两次除去部分杂质，浓缩后加入乙腈-20，冷冻 5-6h 除去葵花油，浓缩后由正庚 烷溶解上硅胶柱层析进一步除去代谢过程中产生的杂质，将得到的硅胶浓缩液进行结晶、过滤，最 终得到利 普 司
21、他 汀 （Lipstatin)成 品 浓 缩 液 。 技术路线： 可行性分析： 1.本实验室有利普司他汀（Lipstatin)发酵液。 2.萃取、浓缩结晶、硅胶层析技术广泛应用在分离提取工艺中。 3.本人已查阅了大量的参考文献，根据前人的成果，并对分离提取的实验操作及理论基础知识 进行了系统的学习巩固。 研究进度安排： 2016.03.012016.05.01：查阅相关参考文献，实验的前期探索。 2016.05.012016.09.01：在原有工艺的基础上去掉大孔树脂吸附，增加乙腈除油工艺。 2016.09.012016.12.01：对提纯后的利普司他汀进行色谱分析，使色谱纯度达 88.092
22、.0%。 2017.03.012017.06.01：对各杂质单体进行、利普司他汀（Lipstatin)样品进行 LC/MS 检测，结合利 利普司他汀发酵液 过滤 乙醇浸提 浸提液浓缩正庚烷萃取浓缩乙腈除油 硅胶层析 色谱分析 杂质分析 普司他汀（Lipstatin) 生物合成途径，解谱确证各杂质结构。 2017.06.012017.08.01：整理实验数据。 2017.08.012017.10.01：撰写论文，准备毕业答辩。 4、研究生本人与课题有关的理论学习、资料查阅及工作基础： （1） 、理论学习 在进行本课题之前有了一年的理论知识学习的过程，主要课程有分离工程进展 、 高级分子 生物学
23、、 现代分析技术 、 、 微生物工程进展 、 酶工程技术原理 、 试验设计与数据分析 、 微 生物制药 、 英语 、 分子生物学软件应用 、 现代液相色谱技术及应用等。 （2） 、资料查阅 1. 网络搜索 2数据库搜索 3图书馆借阅 （3） 、工作基础 实验室拥有双向定时恒温加热磁力搅拌器、离心机、酸度计、电子天平、分光光度仪 、高效 液相色谱分析仪、旋转蒸发器，为实验提供了物质基础，其他所需实验材料和器械也在完备当中。 进入课题以来，边查文献边进行部份工作，熟练掌握了实验所需的各项基本技能，为进一步的 实验奠定了技术基础。 五、开题报告纪录： （1） 、自述开题报告 10 分钟 讲述内容包括本课题的立题背景、研究的目的和意义、国内外研究现状、研究内容与方法，工 作基础与研究进度安排。 （2） 、评议组成员问题及意见 问：利普司他汀的作用机制? 答：利普司他汀（Lipstatin)作为脂肪酶抑制剂，是毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)的次 级代谢产物，能选择性抑制胃肠道中脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收。 问：增加乙腈工艺的目的? 答：代替大孔树脂吸附，达到除油的效果，在降低生产成本的同时，依旧能达到较高的色谱纯 度，为以后的解谱确定各杂质结构工作打下坚定的基础。 记录人签字： 年 月 日
