1、蛋白纯化层析柱 2011-06-15 15:19:14 易生物仪器 浏览次数：1164 网友评论 0 条 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的 液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学 特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是. 关键词： 蛋白离子交换分离分子物质树脂 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要 几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这 些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验
2、的方法注入了新的力量。其中最值 得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF ） ，离子交换层析技术（ion exchange ，IEX） ，羟基磷灰石层析（ hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic intera ction，HI) ，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatograph y，HPLC ） 。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸 运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare（原 Amersham Biosci
3、ences ）的技术顾问 Andrew Mitchell 解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步： 捕获从细胞其它成份，比如 DNA 和 RNA 中分离需要的蛋白； 区分从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋 白； 修饰使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的 beads 大小。 第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和 高流量（flow rate）的填料。bead 大小比较大，范围比较宽（比较于 bead 大小平均值） 的“fast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目
4、标蛋白被水解 因为速度比较快 。 第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常 bead 的 大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的 bead 比较合适。吸附性的技术，比如离 子交换 IEX 和疏水作用 HI 通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后 的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的 体积应该保持在柱床体积的1%到4% 。 选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性这些可以 由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，I EX 和 HI 层析方法就是指目标
5、分子与筛分介质之间的相互作用，而 GF 的选择性依赖于填 料的分馏范围（fractionation range） 。 柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell 表示， “如果 你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead 越大， 洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和 高效性的结合就会得到高分辨率。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography） 、凝胶层
6、 析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy） ，它是在19 60年后发展出来的技术。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔 ，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔 隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较 长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一 般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析 法不同的地方。 目前常用的凝胶包括3个主要
7、类型： 1. Polydextran Polydextran 的商品名称是 Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水 和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Se phadex 依其吸水量有不同型号，如 G-25、G-75、G-100 或是 G-200，G 后面的数字为 凝胶吸水量再乘以10，以 G-25为例，表示1克干燥的 G-25凝胶可以吸水2.5 ml。 GE 的 Sephadex G-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品， 可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也可以在生产上应用 。达柱体积
8、30的样品可通过简单的一次性上柱，脱盐并转换道新的缓冲液中，一些不需 要的低分子量的物质，如盐分子就被洗脱了，这种产品最大的特点就是高速和高容量，处 理起样品来快速高效。 2. Polyacrylamide Polyacrylamide 是一种合成凝胶，商品名 Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶 成胶体，依胶的分离范围不同，分成 Bio-Gel P-2至 Bio-Gel P-300，P 后面的数字乘以10 00为最大过滤限度。Polyacrylamide 的化学性质不活泼，但它在极端的 pH 下会被水解， 水解后产生的 COOH-具有离子交换的性质，因此 pH 值应尽量控制在2-1
9、0 之间。 3. Agarose 商品名 Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为 Sepharose 2B， 4B 和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上 的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以 上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成 beads 后不能再脱水干燥，所 以要在湿态中保存。 凝胶和管柱的选择： 凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应， 最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的 pH 和温度范
10、围内使用。由于凝胶上 的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子 交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度 也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。 凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因 此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用 polydextran 或 polyacryla mide 材质的凝胶，大分子物质则使用 agarose。 以 Sephadex 为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,50030,000之分子，而 Sep hadex G-
11、75 凝胶可区分分子量3,00070,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,0 00之分子，两种都适用。 如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径5：115：1的管柱，且管柱 体积要大于415倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高： 直径20：1100：1的管柱，且管柱体积要大于25100倍的样品体积。 凝胶的处理： 商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的冲洗液中，使它充份膨胀，否 则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于冲洗液中的凝胶加热， 让它膨胀并除去气泡，温度够高的话（加温至近沸腾）也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能
12、 剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。 将凝胶装入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的冲 洗液，边轻轻搅伴边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约12公分的凝胶后，打开下 方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约35公分处停止，让35倍柱 床体积的缓冲液流过层析柱。若用 polydextran 的凝胶，可放入有颜色的蛋白质（如 cytoc hrome c）流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填 装。 冲洗缓冲液仅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗 液流到距表面12 公厘，关闭出口，用滴管缓缓
13、加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶 内后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。 由于 polydextran 和 agarose 都属于多醣类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解 凝胶使其性质改变，为了防止这种情况发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能 过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH 等）也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除 去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95% 逐步脱水，在摄氏6080度 下烘干，不能加热的 Se
14、pharose 则用乙醚洗涤干燥。 离子交换层析（ion exchange，IEX） 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换 剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应 主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸 附作用进行。 离子交换层析法大致分为5个步骤： 1. 离子扩散到树脂表面。 2. 离子通过树脂扩散到交换位置。 3. 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密， 也就愈不容易被其它离子取代。 4. 被交换的离子扩散到树脂表面。 5. 冲洗液通过，被
15、交换的离子扩散到外部溶液中。 离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时 ，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由 于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来 。 如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶 液的 pH 值，所以当溶液的 pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离 子交换树脂上；随着通过的缓冲液 pH 逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱 ，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出 的
16、是酸性氨基酸，如 apartic acid 和 glutamic acid（在约 pH34时） ，随后是中性氨基酸 ，如 glycine 和 alanine。碱性氨基酸如 arginine 和 lysine 在 pH 值很高的缓冲液中仍带有 正电荷，因此这些在约 pH 值高达1011时才出现。 树脂材质： 最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene ） ，它 是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合产生的三维网状结构，举例来 说，Dow 化学公司所生产的树脂 Dowex 508，表示含8%苯二乙烯。 根据交
17、换树脂的性能，分为阳离子与阴离子交换树脂。 1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有RSO3H，中强酸型树脂含 有PO3H2、PO2H2或O PO2H2，弱酸型树脂含有COOH 或OH。 2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 N+(CH3)3 为强碱 型树脂，三级以下铵盐 N(CH3)2、 NHCH3、 NH2 都属弱碱型树脂；同时具 有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型的树脂。 除了树脂以外，纤维素（cellulose） 、葡聚糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（S epharose）也是常用的离子交换材质，特性是具
18、有亲水性和较大的表面积，对生物活性物 质而言，是一个较为温和的环境，同时也是大分子所适用的分离纯化材质 。 实验证明，纤维材质对蛋白质和核酸的分离纯化效果相当好，因为离子交换纤维的种 类多，能依据不同分离目的使用，且功能团基主要在表面，对生物大分子的交换十分有利 。 离子交换剂的选择： 离子交换剂的选择，首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同 pH 值环境中，此 物质所带的电荷和电性强弱。 1. 阴阳离子交换剂的选择 若被分离物质带正电荷，例如 polymyxin、 cytochrome C 这些碱性蛋白质，它们在 酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；其它像 heparin、nu
19、cleic acid 这类 酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂；如果欲分离的物质是两性离子， 一般考虑在它稳定的 pH 范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素（iulin）为例 ，它的等电点为 pH 5.3，因此在 pH5.3 的碱性溶液中，使用阴离子交换剂。 简而言之，已知等电点的物质，在高于等电点的 pH 条件下，因带有负电荷，应采用 阴离子交换，在低于等电点的 pH 下，则采用阳离子交换。未知等电点的物质，在一定 pH 条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附，向阴极 移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。 2. 缓冲液的选择 缓冲液酸碱度
20、的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的 pK 值。使用阴离子交换纤维时要选用低于 pK 值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则 缓冲液的 pH 值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK 值的缓冲液， 目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的 pH 值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如 使用 UV 吸收法测样品，那么 pyridine 或 barbital 这类会吸收 UV 的物质就不适用。 离子交换树脂的前处理： 离子交换树脂使用前，先以蒸馏水除去其内之杂质 ，并以 NaOH 和 HCl 处理树脂， 使
21、其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以15倍于树脂量的 0.5 N HCl 浸泡30120 分钟，再以水清洗至 pH 7.0，之后用0.5 N NaOH 浸泡 30120分钟，同样以水清洗至 pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。阳离子交换树脂用15倍于树脂量的0.5 N NaOH 浸泡3 0120分钟，以水清洗至 pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30120分钟，再以水清洗至 pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。 亲和层析（affinity chromatograph) 亲和层析也称为功能层析（function chromatography） 、生物专一吸附（bioecif
22、ic ads orption）或是选择层析（ selective chromatography） 。所谓的亲和力，即生物大分子和其 配体（ligand ）之间形成可逆结合的能力，如酵素和它的底物（sutrate） 、抗体和抗原、激 素和受体（receptor） 、RNA 和其互补的 DNA 等，亲和层析就是根据这种亲和力发展出来 的纯化方法，例如将酶的 sutrate 接在固体支持物上，再用此支持物填装管柱，当含有这 种酶的样品溶液通过管柱时，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白质及杂质不被吸附，全部 从层析柱流出，最后使用适当的缓冲液，将欲分离的酶从柱中洗出来，经过这些步骤便能 得到纯化的酶。 材
23、质选择： 要进行亲和层析，ligand 的选择相当重要，ligand 可以是辅酶、酶的抑制剂或抗体， 具备的条件如下： 1. 能与要分离的物质进行专一性的结合，亲和力愈大愈好。 2. Ligand 与分子结合后，在一定的条件下又能解离，而且不会因解离破坏原本的生 物活性。 3. Ligand 上具有能连结到固体支持物上的团基，结合后不影响它与欲分离物质的结 合专一性。 在实际操作上，若要纯化的是某一种酶，则 lignad 选用此酶的竞争性抑制剂、底物、 辅酶或是效应剂（effector ） ；若是要纯化酶的抑制剂，就选用此酶作为 ligand；纯化能与 某维生素结合的蛋白质，可以使用这种维生素
24、当 ligand；纯化激素的受体（receptor） ，选 用激素当 ligand。纯化核酸可利用核酸与蛋白质的交互作用、DNA 之间的互补关系、DNA 与 RNA 的 hybridization，运用适当的 ligand。 亲和层析中与 ligand 连接的支持物多为凝胶，凝胶应具备以下条件： 1. 不溶于水，但具有亲水性，如此 ligand 才容易接近水溶液中的欲分离物。 2. 化学惰性，没有（或极少）离子交换这一类非专一性的结合。 3. 具有足够的化学团基，经活化后能与大量的 ligand 结合。 4. 最好是均一的球状颗粒，制成的管柱才能有较佳的流速。 5. 具有多孔网状结构，方便大分
25、子自由通过。 6. 物理及化学性质稳定，不因洗出时改变的各种 pH 值、离子浓度、温度或界面活性 剂而改变其结构。 亲和层析法使用的支持物种类，部份与胶体过滤法重复，除了 Polydextran、Polyacry lamide、Agarose 以外，Ultrogel 是能承受较大压力的凝胶，流速高；cellulose 主要用于 亲和免疫层析，但它有非专一性吸附的性质；Bio-gla 是硼硅酸钠经高温和酸碱处理制成的 多孔玻璃，质地硬、强度高、孔径均匀、不怕微生物侵袭，但缺点和 cellulose 一样，它的 表面对蛋白质也有非专一性吸附。 样品的分离： 要使要分离的物质与 ligand 分离，
26、通常采用改变 pH、离子浓度或缓冲液的组成，使 其亲和力降低，有时使用0.1M 醋酸或0.1M 氢氧化钠冲洗，就能得到不错的效果。如果纯 化对象与 ligand 的亲和力不强，当连续通过大量的平衡缓冲液，就能在杂质洗出后，得到 所要的物质；若亲和力较强，则要使用较强的酸或碱作为冲洗液，或是添加 guanidine hy drochloride，但这些溶液容易使纯化对象失去生物活性；用较高浓度的 ligand 溶液亦可将 管柱上所吸附的物质洗出，此 ligand 可以与管柱上的相同或相异。 对于亲和力小的物质，上柱的样品最好是体积小而浓度高，粘度较大的溶液，可以将 一定量的 ligand 加到待
27、分离的溶液中，搅拌平衡一段时间，进行过滤或离心，最后进行洗 出的步骤。由于生物大分子和其 ligand 间达到反应平衡的速度很慢，样品上柱的流速要尽 量慢；通常亲和力会随温度增高而降低，其中一例是将乳酸脱氢酶从管柱上的 AMP 洗下 来时，所需的 NADH 浓度随温度增高而减少，在摄氏零度到十度间的变化尤其明显，因此 如果待分离的物质在摄氏4度可被紧密吸附，在摄氏25度以上容易被洗下来，则可在 4度环 境下进行亲和吸附，在25度以上的环境进行洗出的步骤。 说到经典的亲和层析柱，当然要提到 GE 公司的王牌产品 Ni Sepharose High Perfor mance 填料，Ni Sepha
28、rose 分有许多不同的凝胶类型，主要是根据凝胶颗粒的大小来区 分，这些镍琼脂糖凝胶产品受到广大科研工作者的欢迎，但基本上都是以层析系统或者散 包装出售的。所以要提一下一款 His inTrap，His inTrap 只需使用一台标准的小型离心机 就可以完成纯化步骤。过程也就是将均一、澄清的细胞裂解物加入到柱子中就可以直接进 行纯化，样品无需离心或过滤处理。所以说 His inTrap 省去了烦杂的样品制备时间，节省 了研究人员的劳动力，每10分钟就可以进行一次小型纯化。因为纯化的时间变短，使样品 降解或者氧化的可能性也变小，也就最大程度保持了样品蛋白的活性。 这个柱子的蛋白结合率达到750u
29、g，并且与系列的添加、变性和还原试剂兼容。由于 它是专门为了小体积蛋白纯化而设计，这系列产品特别适合用于摸索细菌裂解物最佳蛋白 纯化条件。 在产品方面，GE 还有一系列高分辨 液相色谱柱：Tricorn，主要用于分析和纯化包括 蛋白质、肽、核酸、质粒、生物碱、抗生素、病毒、中药活性成份等生物分子而设计的预 装柱。Tricorn 已取代 HR 预装柱，理论塔板数达 35000，分辨率比平均塔板数为8000的 HPLC 柱高四倍，可直接连到 HPLC/FPLC/AKTA 系统。 Tricorn 预装柱可应用于层析聚焦、离子交换、疏水层析、分子筛等四种分离技术中 。其中离子交换方面，Tricorn
30、提供了 MiniBeads(3mm) ，MonoBeads(10mm) 和 SOUR CE (15mm)三种填料适合从分析到小量制备的需要；而在分子筛方面，Tricorn 提供了 Su perdex(窄谱) 和 Superose(广谱) 预装柱。 比如说 Superdex 200 5/150凝胶柱就是一个 Tricon 的预装柱,床层高度为150毫米。 当纯化的时间、样品和缓冲液的消耗显得比获得尽可能高的分辨率更为重要时，这种柱子 是一个很好的选择。Superdex 200 5/150凝胶柱可被广泛应用，例如膜纯化过程中条件的 筛选、蛋白质之间相互作用的研究、快速分析单克隆抗体的纯度和重组蛋白
31、质纯化过程中 需要采用少量缓冲液而不需要采用更长的柱子时。柱子的高效率保证了纯化过程极好的重 复性，并可以在各种不同的纯化系统上操作使用。 除了 GE 以外，默克在色谱领域也是世界上首屈一指的大公司之一，这个世界上最大 的色谱级硅胶和在 GMP 条件下生产吨级二氧化硅的制造商得到了许多顾客和代理商的认 可，其产品线覆盖高效液相分析色谱 HPLC 领域，制备色谱领域，薄层层析色谱领域和样 品前处理。 它旗下的主要色谱柱包括 Lichroher 色谱柱、Puroher STAR 明星家族色谱柱以及整 体化色谱柱 Chromolith，其中 puroherstar 明星家族色谱柱采用合成硅胶为原料，
32、填料的 纯度高，将造成分析困难的金属含量降低至10m 以下，而且，将硅胶表面的键合工艺进行 改进，使得反相填料的酸碱耐受性提高至1.510.5。puroherstar 家族是采用最先进的原 料和技术生产出来的色谱柱。它们融合了重现性好、压力稳定性好的典型特征以及在分离 效率、柱效高和 ph 稳定范围宽的明显优势。 而 Chromolith 整体化 HPLC 色谱柱更是开辟了色谱行业的新纪元，这种柱子是目前世 界上最快的色谱柱。其原理是基于一种全新的液溶胶技术，采用整体化的技术制得。它采 用完全不含重金属离子的四烷氧基硅为原料，采用专利技术制备得到。chromolith 柱中整 体化硅胶棒的多孔体系是由完全创新的两种孔结构组成：大孔结构和中孔结构。其中大孔 的孔径是2mm，相互交联形成了密密麻麻的多孔网络，保证流动相可以快速通过，却不会 造成大的反压；填料骨架上的中孔保证了填料的比表面积，比颗粒型色谱柱的比表面积高 15%(传统颗粒型色谱柱的比表面积为6570%) ，这保证了它的柱效。
