1、肺结核痰检质量控制 万建国 各级各类实验室职责： 县（区）级结核病实验室 在省、地（市）参比实验室的指导下，制定本县（市）结核病实验 室检查的工作计划。 按照国家结核病实验室质量保证体系的要求，做好本实验室开展检 查项目的室内质控工作，承担同级间实验室（县级）第一复检者盲 法复检工作，在所属地（市）级实验室的组织下，开展痰涂片镜检 盲法复检。 按国家统一的标准化操作程序常规开展痰涂片镜检工作，根据实际 情况有能力、具备条件的可以开展结核菌培养。 接受上级实验室的督导、现场评估和定期培训。 对辖区内乡镇卫生院查痰点的工作提供技术支持。 乡镇查痰点 乡镇查痰点在我国结核病防治工作中发挥着重要作用，
2、它可以方便 结核病可疑症状者就医，增加病人发现。各地应根据实际情况设立 乡镇查痰点。 乡镇查痰点应该按卫生部要求开展工作，国家统一的标准化操作程 序开展痰涂片镜检工作，并按规定送痰涂片至县级进行复检； 接受上级实验室的培训、现场督导和技术指导。 医疗机构实验室 医疗机构结核病实验室在相应级别临床检验中心和上级结核病实验 室的技术指导下，开展质量有保证的结核病实验室检查工作，严格 按照相关各项标准化、规范化操作程序进行实验室相关活动，并接 受结核病实验室的质量控制。 涂片镜检实验室基本要求： 实验室应有实验室分区（涂片染色区域和读片镜检区域） ，布局应该 符合生物安全二级（BSL-2）的要求；
3、实验室应在靠近出口处设置洗手池； 实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品 和消毒剂的腐蚀，地面应防滑； 实验操作台面应能防水，耐腐蚀、耐热； 实验室中的厨柜和实验台应牢固，厨柜、实验台彼此之间应保持一 定距离，以便于清洁； 对于实验室中可开启的窗户，应安装纱窗； 实验室内应保证工作照明，避免不必要的反光和强光； 应有适当的消毒设备； 在实验室门口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置； 10、实验室应该装备开展痰涂片检查所需要的仪器和设备。 检查对象及要求： 痰涂片检查 （一）痰盒 推荐使用螺旋盖、可密封、广口的塑料盒收集痰标本，参考规格： 直径 4 厘米，高度 2
4、 厘米。医务人员在容器上应注明患者姓名、编 号（门诊序号或登记号） 、检查项目、痰标本序号 1、2、3（1当 日即时痰，2夜间痰，3次日晨痰） ，然后交给患者。 （二）标本采集 1、时间 根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类： 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第 2 口、第 3 口痰液； 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液； 2、痰采集方法宣教 对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本 质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰 的方法；如患者识字，可提供宣教材料。 3、地点 由于当患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有
5、结核菌的气溶胶，感染周 边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行， 或在通风良好的室内进行。 患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质 量（特别是用于初次诊断的痰标本） 。合格的痰标本应是患者深呼吸 后，由肺部深处咳出的分泌物，标本量一般在 35 ml。 干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色） 、脓样、团块状的肺部分泌物 为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发 现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深 处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故 AFB 的检出率较高。 血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色 为褐
6、色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察 到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染 色的血细胞。由于含血标本易干扰 AFB 镜检的结果，故在制片时应 尽量避免挑取含血标本。 粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主， 制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛 柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较 深，细胞一端可见着色较浅的纤毛） ，伴有少量肺上皮脱落细胞（多 数为圆形、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于 1:3） 、脓性 炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比低 于 1:1） 、口腔
7、脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的 AFB 检出率较唾 液高。 唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的 口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可 见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核着色较细胞质深， 核质比接近或大于 1:2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由 于此类标本进行 AFB 检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时 是不合格的标本。 合格的痰标本一般为干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、 粘液痰。痰标本不合格时，应进一步指导并要求病人重新送检。进 行细菌学检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分 析结果时参考。 直接涂片检查
8、检查对象根据检查目的分为两类：确定诊断，发现传染源；疗效评 价，作为确定化疗方案和治疗效果评价的指标。 （1）确定诊断：凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，均 应进行痰涂片检查。确定诊断的涂片检查应采集 3 个合格的痰标本。 就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者 2 个痰盒，嘱 患者留取“夜间痰”和“晨痰” ，于次日交验。 （2）疗效评价：凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间 按照规定应定期查痰： 初治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满 3 个月和继续期结束时 （一般为治疗后的第 2、5 和 6 个月） ；复治涂阳患者在疗程强化期 末、继续期满 3 个月和继续期结束时（一
9、般为治疗后的第 2、5 和 8 个月）分别收集一份晨痰和即时痰进行涂片检查。 初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在 1 个月时增加痰涂片检查一次；若复治涂阳患者治疗满 3 个月时痰 菌仍阳性，应在治疗满 5 个月增加痰涂片检查一次。 确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应 在登记后满 2 和 6 个月时进行痰菌检查 （一）玻片的制备 1、用于抗酸菌（AFB）检查的载玻片要求 （1）一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。 （2）每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于 AFB 涂片检查。 （3）应使用以 95%乙醇擦拭（或浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油 污、无划
10、痕的新载玻片制备涂片，在玻片背面一端的 1/3 处注明实 验室序号及标本序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻 璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用 2B 铅笔在 磨砂面上直接书写） 。 2、制备涂片 （1）小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。 （2）仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、 脓样或可疑部分约 0.050.1 ml，于玻片正面右侧 2/3 处，均匀涂 抹成 1020 mm 的卵圆形痰膜。痰膜朝上静置自然干燥后（一般约 需要 30 分钟）进行染色镜检。 （3）涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。 （4）为了保证检验人员的
11、安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻 片进行加热。 （二）染色 1、萋尔尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson） ，简称萋尼氏染色法（Z- N） （1）试剂的配制： 石碳酸复红染色液： 碱性复红储存液：碱性复红 8g 加 95%酒精至 100 ml，充分振荡使复 红溶解。 5%石碳酸水溶液：40-50水浴加热石碳酸使之融解，取 5 g 液态石 碳酸溶于 90ml 热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至 100 ml。 石碳酸复红工作液：10 ml 经定性滤纸过滤的碱性复红储存液与 90 ml 5%石碳酸水溶液充分振荡、混合均匀后，使用定性滤纸过滤。 5%盐酸乙醇脱色液：5 ml 浓盐酸
12、（35%）与 95 ml95%乙醇混合。 亚甲兰复染液： 储存液：0.3 g 亚甲兰溶于 50 ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水 至终体积 100ml。 亚甲兰复染液：以蒸馏水 3 倍稀释 0.3%亚甲兰储存液，经充分 振荡、混合均匀后，亚甲兰的终浓度为 0.1%。 使用定性滤纸过滤，即得亚甲兰复染液。 （2）染色步骤： 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持 10 mm 以上 的距离；火焰固定（在 5 秒钟内将玻片置于火焰上烤 4 次） 。 滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离 火焰，保持染色 5 分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖， 必要时可续加染色液。
13、加温时勿使染色液沸腾。 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色 3 分钟；如有必要， 需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 滴加亚甲蓝复染液，染色 30 秒钟。 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的 水。待玻片干燥后镜检。 一张染色合格的玻片，由于被亚甲兰染色而呈亮蓝色。将染色后 的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表 明该玻片涂抹过厚。 2、荧光染色法 AFB 采用荧光染色法镜检，只限于那些每日工作量较大（日读片数 超过 2
14、5 张） 、具备荧光显微镜、且镜检人员阅读荧光染色玻片具有 丰富经验的实验室开展。 （1）试剂配制： 染色剂（金胺 O 染液）： 金胺 O 1 g 石碳酸 50 ml 乙醇 100 ml 补蒸馏水至 1000 ml 金胺 O（auramine O，分子式为 C17H21N3HCl）：用于 AFB 染色 时必须使用最低染料含量约 80的生物染色剂。 脱色剂：3%盐酸乙醇（配制方法参照萋尼氏染色） 。 复染剂：0.5%高锰酸钾水溶液。 （2）染色步骤： 玻片经火焰固定后,滴加染色剂盖满玻片，染色 30 分钟；流水自 玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。 自痰膜上端外缘滴加脱色剂，布满
15、痰膜，脱色 3 分钟或至无色, 流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。 滴加复染剂复染 2 分钟，沥去复染液，自然干燥，准备镜检。 （三）镜检 1、萋尼氏染色玻片镜检 使用 10目镜双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜 向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用 40物镜，转动卡尺 移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细 胞形态；移开 40物镜，在玻片上滴 12 滴镜油，使用 100油镜 进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其它细菌和细胞 呈蓝色。为防止 AFB 的交叉污染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的 痰膜。 由于香柏油（cedarwood immersion
16、oil）能够溶解复红染料，使萋 尼氏染色退色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故推荐使 用专门用于 100油镜、不干燥、不变硬的镜油（immersion oil） 。 读片时，首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端 时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常 20 mm 的痰膜，使用 100油镜，每行可观察约 100 个视野。 仔细观察完 300 个视野，一般需要 5 分钟以上；每个工作日，一位 镜检人员的玻片阅读量不要超过 25 张，且连续阅读 1012 张玻片 后，应休息 20 分钟左右。 2、荧光染色玻片镜检 玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后，首先以 10
17、目镜、20物镜 进行镜检，发现疑为 AFB 的杆状荧光颗粒时，使用 40物镜确认。 在暗背景下，抗酸菌发出杆状荧光。 相应波长光线激发染料产生可视光的能力，随着时间而衰减。故荧 光染色后的涂片应于当日镜检；如果玻片数量过多，应将涂片放置 于 4避光保存，次日必须完成镜检。 （四）结果报告 1、萋尼氏染色镜检结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性（）：连续观察 300 个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：12 条抗酸杆菌/300 视野。 抗酸杆菌阳性（1）：39 条抗酸杆菌/100 视野。 抗酸杆菌阳性（2）：19 条抗酸杆菌/10 视野。 抗酸杆菌阳性（3）：19 条抗酸杆菌/每视野。 抗
18、酸杆菌阳性（4）：10 条抗酸杆菌/每视野。 2、荧光染色镜检结果分级报告标准 荧光染色抗酸杆菌阴性 （-）：0 条/50 视野。 荧光染色抗酸杆菌阳性（报告抗酸菌数）：13 条/50 视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：1099 条/50 视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）：19 条/视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）：1099 条/视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：100 条/视野； 玻片的保存 1）萋尼氏染色玻片阅读完毕后，应及时使用浸满二甲苯（分析纯） 的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。 （2）经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片 盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。 （3）荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在 4冰箱 保存。 （4）荧光染色涂片质控时，应首先将复检涂片进行萋尼氏染色后， 重新阅读。
