透明质酸的发酵生产工艺.doc

1、食品与制药工程学院课程论文 透明质酸的发酵生产工艺 专业：生物制药 姓名：邓海艳 课程名称：发酵工程 摘 要：透明质酸广泛分布于各种动物组织中，由于动物组织原料有限，且透明 质酸的含量低，同时提取成本高，因而价格十分昂贵。而微生物发酵法，所需的原料 易得，大大降低了生产成本。同时由于透明质酸存在于菌体英膜上，易于与菌体分离， 因而减少了提取成本。本篇文章就是以一株兽疫链球菌作为生产菌株进行研究重点讨 论了温度、pH 值、搅拌转速，发酵时间以及培养方式等发酵条件对透明质酸产量和 分子质量的影响。 关键词：透明质酸；产量；影响因素；发酵条件 透明质酸（hyaluronic acid，简称 HA）又

2、名玻璃酸，是一种高分子量的酸性黏多 糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中。HA 分子中的羧基和极性基团可与 水形成氢键而结合大量的水，可以吸收与保持自身体重千倍以上的水分，是国际上公 认的最好的保湿剂，还具有润滑，促进关节愈合等作用 1。不同分子质量的 HA 有不 同的用途，低分子质量的 HA 通常用作食品原料，中等分子质量的 HA 主要应用于化 妆品，而高分子量的 HA 在医学上有较高的应用价值。 1.透明质酸的微生物发酵法 从上个世纪 30 年代开始，人们便开始进行微生物发酵法生产 HA 的研究。微生 物发酵法生产 HA 较动物组织提取法有许多的优点，比如生产成本低廉，规模不受原 料

3、限制，因为发酵液 HA 以游离状态存在所以易于 HA 的分离纯化。能够产生 HA 的 链球菌有 A 群和 C 群两类，其中 A 群主要有化脓链球菌, 一般不用作生产菌种，因 为其致病性较高；C 群有兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌等均属于非人体致病 菌，所以可以用作 HA 的生产菌种罗瑞明等从患肺炎的羊肺液中分离出兽疫链球菌菌 株，通过培养基优化得到的 HA 产量为 1.88 g/L。冯建成等以 Streptococcus equiSHO 为出发菌株，通过物理和化学诱变选育到 1 株遗传稳定、无溶血性且透明质酸酶缺陷 型菌株 SH0201，通过摇瓶发酵试验得到相对分子量 2.06xl06 D

4、a 的 HA。李自刚等从 奶牛鼻黏膜内分离到 1 株兽疫链球菌，经过紫外线诱变和亚硝基胍诱变处理后 HA 产 量能达到 6.94 g/L2。通过微生物发酵法生产 HA 的品质和产量主要受到以下几个方 食品与制药工程学院课程论文 面的影响: 首先是菌种选择；其次是培养基的 优化和发酵条件的优化；最后是生物工艺的下游技术即 HA 的提取工艺。国内外诸多 学者研究了微生物发酵法生产 HA 的工艺。国内，凌沛学等首先开始对 HA 的发酵生 产的工艺进行研究，分别进行了实验室小试和生产车间中试的研究；陈永浩等利用 射线和紫外线结合方法和通过辐照进行诱变育种，得到了没有溶血性的菌株，使得 HA 产量及相对

5、分子质量得到了进一步的提高；杨利等对透明质酸分子量的影响因素 进行了探索，得到溶氧水平和搅拌转速与 HA 分子量的关系；付莉等从自然界蹄选到 一株透明质酸的产生菌；叶华等对于透明质酸发酵流加过程进行了研究；史鹏等，对 发酵法生产透明质酸提取工艺方法进行了研究；郝宁等对 HA 的生产菌进行了基因改 造，基因重组菌的 HA 产量得到很大程度的提高。HA 的发酵生产主要工艺流程如下: 斜面种子一摇瓶种子一接种一发酵培养一补料一放罐一发酵液（加乙醇粗提）一 粗提液（加助滤剂、活性炭，调 pH）过滤（去除杂质）一滤液（乙醇沉淀）一沉 淀物（脱水干燥）一成品透明质酸 2.发酵培养基成分和发酵条件对 HA

6、的影响 2.1 不同碳源对发酵的影响 当碳源为 2.0%，酵母膏 1.0%，蛋白胨 1.0%，KH 2PO4 0.2%，NaCl 0.2%， MgSO47H2O 0.03%，pH7.2，装量为 10%；37，100 rpm 培养 18 h。 以葡萄糖为碳源时，透明质酸的产量最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖和果糖。而 木糖和半乳糖利用情况不好，以它们为碳源时透明质酸产量只有 0.4 g/L 和 0.42 g/L。 其原因可能是 UDP-葡糖醛酸和 UDP-N-乙酰氨基葡萄合成透明质酸的前体物质，也是 合成菌体的前体物质，菌体可以容易地分解蔗糖和麦芽糖得到葡萄糖，果糖也很容易 转化为葡萄糖，所以它们能

7、被比较好的利用，而其他两种碳源的利用情况则相对差些。 因此本实验采用葡萄糖为碳源。 2.2 不同氮源对发酵的影响 当氮源为 2.0%，葡萄糖 2.0%，KH 2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO 47H2O 0.03%， pH7.2，装量为 10%，37，100 rpm 培养 18 h。 氮源不仅为菌体生长提供氮元素，而且大多数有机氮源还能提供多种必需的生长 因子。当发酵培养基的氮源采用酵母膏时，透明质酸的产量最高。其次是酵母膏和蛋 食品与制药工程学院课程论文 白胨的混合氮源，其余的均较底。而采用无机氮源（NH 4） 2SO4 时，透明质酸含量和 菌体量都是最低的。兽疫链球菌的营养要

8、求比较高，TCA 循环不完全，有多种氨基酸 不能自身合成，而且不能完全由自身合成核昔酸。而酵母膏中含有大量的菌体生长所 需的生长因子，这可能是兽疫链球菌 H-35 以酵母膏为氮源时生长和发酵较好的原因 之一。 2.3 酵母膏用量对发酵的影响 当氮源为酵母膏，葡萄糖 2.0%，KH 2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO 47H2O 0.03%， pH7.2，装量为 10%，37，100 rpm 培养 18 h。 低酵母膏用量时，细胞产出的透明质酸含量较低，细胞量也较低，逐步提高酵母 膏的含量，透明质酸含量和细胞量均有大幅提高。当加入量为 2%时，透明质酸含量 达到最大值。所以本研究中选

9、用酵母膏为氮源，用量为 2.0%。 2.4 不同温度对发酵产物的影响 发酵过程中，温度是一个关键的因素，对菌体生长、代谢速度有很大的影响。当 温度为 35时，HA 产量最高，达到 1.07g/L；当温度高于 35，透明质酸的产量却 随温度的升高而呈下降的趋势。但在实验温度范围内菌体生长却随温度的升高菌体量 增多，表明高温有利于菌体的生长，碳源更多的转化为菌体。所以本实验发酵温度为 35。 2.5 搅拌转速对 HA 产量和分子质量的影响 搅拌转速是影响发酵液溶解氧浓度的关键因素之一。HA 是 HA 产生菌荚膜的主 要组成成分，搅拌可以强化气-液间氧的传递，既维持发酵液中有足够的溶氧，为细 胞的生

10、长提供氧气，又可使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利于细胞的吸收和利 用，同时可以加速荚膜从细胞表面脱离。高海军报道，只有在高搅拌转速时发酵体系 才处于全部混合状态，在较高的搅拌速率 650 r/min 下发酵时可以得到较高的 HA 产 量，为 411 g/L，产率系数为 0.083。这是因为 HA 溶液是假塑性物体，具有剪切变稀 的特性，高速搅拌时，发酵液传质，传氧性能得到改善，有利于菌体生产和产物合成， 同时，较高速的搅拌能使荚膜更快地脱落，解除其对细胞吸收营养物质的阻碍。 Hasegawa，却认为，HA 的产量在一定搅拌速度内会随着搅拌速率的增加而增加，并 且随着换气速率的加快，HA 的

11、产量也会增加，然而过高的搅拌速率会破坏细胞而导 食品与制药工程学院课程论文 致 HA 产量下降，这是因为过高速的搅拌会产生很大的剪切作用，对所培养的菌体细 胞造成伤害，使得受损细胞合成 HA 的能力大大下降了。而成霞则认为在发酵前期采 用较低的搅拌转速（200 r/min） ，使菌体细胞能快速生长，发酵开始 10 h 后适当提高 搅拌转速（350 r/min） ，一方面可通过降低菌体的生长速率来降低乳酸的积累量；另 一方面由于此时发酵液很黏稠，提高搅拌转速可以促进混合，有利于 HA 发酵的进行。 David 将搅拌速度从 3001000 r/min 进行变化，HA 的分子质量基本没有改变 4。

12、 2.6 不同装量对发酵产物的影响 随着装量增大，菌体生长较好，但透明质酸的产量在 8%的装量时出现高峰。说 明了装量越大，溶氧越低，不利于透明质酸的合成。因此发酵中发酵液的装量采用 8%。 2.7 发酵条件的优化 根据文献选择对兽疫链球菌生长及产透明质酸影响较大的四个因素（初始葡萄糖 浓度、MgSO47H 2O 的浓度、初始 pH 和摇床转数）来设计正交试验表。其它相同的 条件为：酵母膏 2.0%, KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2% ，装量为 8%，培养 18 h。 通过极差分析，影响因素大小依次是：pH摇床转速 MgSO4；含量初始葡萄 糖。最优组合是 pH7.0，摇床转速 20

13、0 rPm，MgSO 4 含量 0.06%，初始葡萄糖浓度 4.0%。 在初始葡萄糖浓度 4.0%，酵母膏 2.0%，NaCl0.2%，KH 2PO4 0.2%，MgSO47H 2O 0.06%，初始 pH7.0，装量为 8%，35，200 rpm 培养 18 h。实验的结果是透明质酸 产量为 1.43 g/L，比优化前提高了 28.8%。 pH 是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产物的积累有很大的影响，发酵 液的 pH 可以影响微生物细胞原生质的电荷，引起各种酶活力的改变，影响菌体对基 质的利用速度和细胞的结果，以致影响菌体的生长和产物的合成 5。从实验数据可知， pH7.0 时对发酵有

14、利，过低和过高都不利于发酵产物的积累。 摇床转速表明，转数越高，越有利于透明质酸的合成和分泌。原因是高转数，发 酵液传质、传氧性能得到改善，有利于菌体的生长和产物合成。由于荚膜会阻止营养 物进入细胞，从而影响细胞的生长代谢和透明质酸的合成以及分泌。较高的转数能使 荚膜更快的脱落，解除荚膜对细胞吸收营养物质的阻碍。 食品与制药工程学院课程论文 透明质酸合成酶是透明质酸合成途径中的关键酶,该酶位于原生质体膜上。它催 化透明质酸的前体 UDP-葡糖醛酸和 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转化成 H，此酶的活性受 Mg2+离子浓度的影响很大 6。当 MgSO47H2O 为 0.06%时透明质酸合成酶活性最高

15、。 因此兽疫链球菌 H-35 最佳发酵条件是初始葡萄糖浓度 4.0%，酵母膏 2.0%，NaCl 0.2%， KH2PO4 0.2%，MgSO47H 2O 0.06%,初始 pH7.0，35,装量为 8%,200 rpm 培 养 18 h。 3.透明质酸的纯化 参照应国清分离纯化玻璃酸的研究，采用阴离子交换树脂 DEAE-纤维素对透明质 酸粗品进行洗脱。以去离子水为淋洗液，0.6 mol/LNaCl 溶液作为洗脱液，分别测定流 出液中透明质酸的 O.D530 值和蛋白质的 O.D280 值。从中可看出，0.6 mol/LNaCl 溶液 作为洗脱剂时，透明质酸出峰时间早，峰形陡峭，峰值较高，拖尾

16、较小，并且含蛋白 质的量很低。通过考马斯亮蓝染料结合法测得粗品和纯品的蛋白质含量分别为 2.84% 和 0.38%，说明经过 DEAE-纤维素纯化以后，透明质酸得到很好的分离。 食品与制药工程学院课程论文 结 论 虽然目前国内对微生物发酵法生产 HA 的研究逐渐增多，但是大部分还只是在实 验室进行研究，对于将其投入工业化生产的技术还不够成熟。尽管相对于动物提取法， 产量有了很大提高，但是由于 HA 的需求增长非常快，产量仍是一个需要突破的瓶颈。 因此，发酵工艺条件作为影响 HA 产量的一个重要因素，特别是从工业化的角度上考 虑时，仍需进一步的研究和探索。今后，应在以下几方面展开进一步的研究：一

17、是选 育透明质酸酶缺陷型菌株，并根据 HA 的合成和代谢途径，进行发酵条件的优化，并 通过建立动力学模型对生产进行评估；二是目前对发酵法生产 HA 的研究多集中于分 批发酵，而分批发酵的转化率低，有底物抑制，葡萄糖效应，代谢阻碍等问题，不适 合投入工业化的生产，应在补料分批发酵或连续发酵方面进行深入的研究。 食品与制药工程学院课程论文 参考文献 1郭学平，透明质酸在保健品中的应用 J，中国生化药物杂志，2002，23（1）： 49-51 2周荣清，透明质酸发酵液的絮凝预处理研究 J，食品与发酵业，2001，27（12）： 16-18 3李建武，生物化学实验原理和方法 M，北京大学出版社，200

18、1，4：174 4杭生，透明质酸的离子交换层析纯化 J，中国医药工业杂志，2001，32（11）： 485-488 5高海军，营养条件对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响 J，生物工程学报， 2000，16（3）：396-399 6鲁念慈，透明质酸的制备及其应用 J，功能高分子学报，2001，14（3）：370- 376 食品与制药工程学院课程论文 课程论文成绩评定表 姓 名 邓海艳 专业班级 生物制药 学 号 201250797 折合成绩 考核指标 主要考核点 等级 分 数 论文题目 选题 、定位 、意义 、表述 A:10 分 B: 8 分 C: 6 分 写作水平 语言文字 、逻辑结构 、论证能力 A:30 分 B:24 分 C:18 分 文本规范 摘要与关键词 、字数 、格式 A:20 分 B:16 分 C:12 分 参考文献 引用合理 、质量 、数量 、规范 A:20 分 B:16 分 C:12 分 成果水平 创新程度 、理论价值 、应用价值 A:20 分 B:16 分 C:12 分 教师签名 总计 食品与制药工程学院课程论文 年 月 日