1、透明质酸的稳定性考察 郭凤仙 郭学平 李国民 透明质酸（Hyaluronic Acid，简称 HA）是 1934 年 Mayer 发现并命名的。 国内外对 HA 的性质、生物活性、生产工艺、临床应用等方面都进行了广泛深入 的研究，目前主要应用于医药和化妆品方面。HA 是由糖苷键相连接的氨基葡萄 糖和葡萄糖醛酸的双糖单位重复连接组成的直链聚合物，羧基上的负电荷和较 长的可折叠分子链使得分子空间伸展特别大，因此 HA 溶液具有较高的黏度 1， 分子量越大，黏度越高。HA 分子链降解后，主要表现为黏度下降。本实验通过 改变 HA 存放时的温度、酸碱度和离子强度，定期测其运动黏度，对 HA 的稳定 性
2、进行了考察。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 恒温水浴（0.1 C） ；平氏黏度计（毛细管内径为 1.0mm0.05mm） ；电热 恒温培养箱；电热恒温干燥箱 ；pH 计。 HA，山东福瑞达生物化工有限公司生产，批号 20000217 、20000219； 0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl。 1.2 方法 1.2.1 HA 运动黏度的测定 2 精密称取按干品计算的 HA 粉末 0.1g 于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水溶解定 容至刻度，在 25C 恒温水浴中，测定其在平氏黏度计中的流出时间（s ） ，与该 黏度计的黏度计常数（mm 2/s2）相乘，即得 HA 的运动黏
3、度，以 mm2/s 为单位。 1.2.2 温度对 HA 稳定性的影响 1.2.2.1 温度对固体 HA 稳定性的影响 将 HA 配成 0.1%(g/ ml)的水溶液，测其运动黏度，作为初始黏度。分别称 取 HA 固体粉末约 1g 于容量瓶中，置 4C、28 C、 40C、60C、80 C、100C 下恒温保存。一定时间后分别取出，配成 0.1%的水溶液，测定运动黏度。 1.2.2.2 温度对 HA 溶液稳定性的影响 将 HA 固体粉末用蒸馏水溶解，配成 0.1%的溶液，分装于容量瓶内，在上 述温度下恒温保存，定时取样测定运动黏度，方法同上。 1.2.3 酸碱度对 HA 溶液稳定性的影响 取 H
4、A 固体粉末 1.25g，用 0.9%的 NaCl 配成 0.25%HA 溶液 500ml,调 pH 为 7，测其运动黏度,作为初始黏度。再将 HA 溶液分装于 5 个烧杯内，分别用 移液管滴加 NaOH 或 HCl 试剂，使溶液 pH 值分别为 5、6、7、8、9。五个烧杯 于 80C 下恒温保存 12h 后取出 ,分别调 pH 值为 7.0，补加 0.9%的 NaCl 或蒸馏 水使 NaCl 浓度及 HA 浓度相同，测其运动黏度。 1.2.4 离子强度对 HA 溶液运动黏度的影响 取 1g HA 固体粉末配成 0.2%的溶液 500ml，再分别配制 4、3、2、1、0.4、0.2mol/L
5、 的 NaCl 溶液各 50 ml。量取 HA 溶液 50ml 6 份分别 加入上述 6 种盐溶液混匀。然后分别测其运动黏度（0.1%HA 水溶液运动黏度为 空白黏度） 。 2 结果 2.1 温度对 HA 稳定性的影响 结果见图 1、图 2 和图 3、图 4。 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 保 存 时 间 （ 天 ） 运动 粘度 (mm /s ) 4 28 40 60 0 10 20 30 40 0 20 40 60 保 存 时 间 (小 时 ) 运动 粘度 (mm /s ) 80 100 图 1 固体 HA 不同温度保存时运动黏度测定结果 0 10 20 30 40
6、 50 0 10 20 30 40 保 存 时 间 (天 ) 运动 粘度 (mm /s ) 4 28 40 60 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 60 保 存 时 间 （ 小 时 ） 运动 粘度 (mm /s ) 80 100 图 2 HA 溶液不同温度保存时运动黏度的测定结果 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 保 存 温 度 （ ） 运动 粘度 （m m / s) 固 体 液 体 图 3 HA 放置 10 天时运动黏度与温度的关系 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 60 保 存 时 间 （ 小 时 ） 运动
7、 粘度 （m m / s) 80 100 图 4 固体 HA80C 和 100C 保存时运动黏度与时间的关系 2.2 酸碱度对 HA 溶液稳定性的影响 结果见图 5 图 5 不同 pH 值对 HA 溶液运动黏度的影响 2.3 离子强度对 HA 溶液运动黏度的影响 结果见图 6。 0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 1 2 3 氯 化 钠 浓 度 （ mol/L) 运动 粘度 （m m / s) 图 6 不同离子强度对 HA 溶液运动黏度的影响 3. 讨论 图 1、图 2 和图 3、图 4 表明，温度对 HA 的稳定性影响很大，HA 的存放 状态不同，稳定性不同。HA 的最佳保存方
8、式为冷藏，溶液状态 HA 比固体状态 0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 pH值 运动 粘度 （m m / s) HA 稳定。这可能与溶液状态下 HA 与空气中的氧气接触比固体状态下少有关， 因溶液状态下 HA 分子间的空气均被排出。固体 HA 40C 保存 10 天，其运动黏 度下降 18.4%；而 HA 溶液 40C 保存一个月运动黏度基本不变。 80C、100C 放置 48h，两种状态 HA 运动黏度下降十分明显，这说明 HA 在温度较高时不稳 定,但 HA 溶液在 80C 加热 4h 和 100C 加热 1h, 运动黏度稍有下降，说明 HA 溶液可进行巴氏消
9、毒。此结果对含 HA 的医药制剂和化妆品的生产中的灭菌问题， 具有重要意义。生产过程中可单独对 HA 溶液进行巴氏消毒，也可与其他料液混 合后或乳化时进行巴氏消毒。以往许多人有一种误解，认为 HA 溶液不能加热灭 菌，否则会导致降解。 图 5 表明，pH 值为 6、7、8 时运动黏度变化不大， pH 为 5 时运动黏度下降 最为明显。pH 为 7 时运动黏度最大。这说明 HA 在中性时稳定性最好，所以生 产时要求 pH 值尽量维持在中性状态。pH 值分别为 5 和 6 的 HA 溶液在 80C 放 置 12h 后重新测 pH，pH 值均有所升高，这可能是酸破坏 HA 结构所致，这一点 在 HA
10、 生产中也应注意。 从图 6 可以看出，0.1%HA 溶液当 NaCl 浓度由 0 增加到 0.1mol/L 时，运动 黏度从 23.5 降至 2.41，变化显著，当浓度再逐渐增加时，运动黏度基本不变， 不再随离子强度的增加而降低。这提示我们在生产或使用 HA 时，其过程中如有 盐生成或需加入盐时应充分考虑离子强度对 HA 运动黏度所产生的影响。 实验中所选温度根据实验室现有条件而定，实验时为尽量减少称量误差， 需一次配好溶液，然后分装，在配制 HA 溶液时，需加入防腐剂甲醛，其浓度为 0.1，否则溶液在整个实验过程中可能长菌，特别是溶剂为生理盐水时，溶解 过程中，溶液如变混，即可能已有菌生成。 考察酸碱度对 HA 的影响时，最后溶液离子浓度、pH 值、HA 浓度都调至 相同，即各溶液在测定时条件一致，这是为了排除测定时这些因素对 HA 运动黏 度所产生的其它影响。 参考文献 1 王凤山，凌沛学，郭学平，等. 生化药物研究. 北京：人民卫生出版社， 1997：266271 2 国 家 药 典 委 员 会 .中 华 人 民 共 和 国 药 典 ， 北 京 ： 化 学 工 业 出 版 社 ， 2000： 4446（ 附 录 ） 原文发表于：山东省药学会第五次生化药物学术研讨会论文集，济南， 2001， 4852
