1、Clin ica l Exper ience临床经验 胸水脱落细胞DNA含量及VEGF, p53和 CEA表达在良恶性胸 腔积液鉴别中的意义 周 箴1 ,陈 岗2 ,宣学金2 ,张 俭2 (1. 上海市肺部肿瘤临床医学中心,上海 200030; 2. 上海交通大学附属胸科医院病理科,上海 200030) 摘要 目的:探讨检测胸水细胞的DNA 倍体以及VEGF、p53、CEA表达鉴别良恶性胸腔积液的价值。 方法: 73例胸腔积液患者,良性组13例,恶性组60例。图像细胞光度技术( image cytometry, ICM)进行DNA含量 检测,免疫组化Envision法检测VEGF、p53、CE
2、A。 结果:良性胸水DNA异倍体率仅占23. 1% 。恶性胸水的异倍体率占77. 8% ,两者有统计学差异( P = 0.001) 。 良性胸腔积液患者VEGF、p53、CEA表达率分别为12. 5%、0、0。恶性胸腔积液 VEGF、p53、CEA表达率 分别为17. 5% ,17. 5%和68. 4% ,与良恶性胸腔积液中CEA的表达相比有统计学差异 ( P 0. 001) ,VEGF和p53的 表达无显著差异( P = 0.722, P = 0. 198) 。经DNA倍体联合VEGF、p53、CEA检测,敏感率可达90. 4% ,特异度 87. 5% ,符合率90%。 结论: ICM检测胸
3、水细胞的DNA倍体联合VEGF、p53、CEA表达值得进一步探讨 ,有可能成为鉴别良恶性胸 腔积液的又一方法。 关键词 肺肿瘤; 胸腔积液,恶性; DNA; 基因表达; 免疫组织化学; 诊断,鉴别 中图分类号 R734. 2; R730. 43 文献标识码 A 文章编号 100027431 (2007) 0220155203 Clin ica l sign if icance of DNA content and VEGF, p53 and CEA expressions in the differentia l diagnosis of ma lig2 nant and ben ign pl
4、eura l effusions ZHOU Zhen1 , CHEN Gang2 , XUAN Xue2jin2 , ZHANG J ian2 ( 1. Shanghai Lung Tumor ClinicalMedical Center, Shanghai 200030, China; 2. Department of Pathology, Shanghai Chest Hosp ital of J iaotong University, Shanghai 200030, China) ABSTRACT Objective: To investigate whether nuclear DN
5、A content and vascular endothelial growth factor (VEGF) , p53 andcarcinoembryonic antigen (CEA) exp ressions had a potential value in differential diagnosis of malignant and benign p leural effusions. Methods: Seventy2three patientswith unilateral p leural effusion were divided into 2 group s: benig
6、n group ( n = 13) andmalignant group( n = 60). The DNA contentwasmeasured by the image cytometry ( ICM) and the level ofVEGF, p53 and CEA exp ressionswere de2tected by immunohistochemical Envision method. Results: The rates of aneup loid in benign and malignant p leural fluids were 23. 1%and 77. 8%
7、, respectively. The difference between the benign andmalignant p leural effusionswas significant ( P 0. 001). Immunohis2tochemical staining showed that the positive rates of the VEGF, p53, and CEA in benign p leural fluid were 12. 5% , 0, and 0; in ma2 lignant p leura1 fluid were 17. 5% , 17. 5% , a
8、nd 68. 4% , respectively. The difference in CEA between the benign and malignant p leu2 ral effusion was significant ( P 15% 以上的超二倍体细胞群(即S期细胞)和一个明显的四倍体细 胞峰位诊为异位体阳性(图1)。 图1 DNA含量检测图 Fig. 1 DNA con ten t by ICM A: DNA dip loid; B: DNA aneup loid 1. 2. 2 免疫组化VEGF、p53、CEA的检测 免疫组化Envision法, VEGF 、p53、CEA
9、单克隆 抗体及DA2KO Envision试剂盒均购自长岛公司。阳性判断标准:试剂盒中阳性片为阳性对照, PBS取代一抗为阴性对照。VEGF、CEA以细胞质( 膜)染色呈棕色视为阳性。 p53以细胞核染 色呈棕色视为阳性。其表达的判断以染色强度和阳性细胞百分率之和进行评估 2 。染色强 度: 0 分,为无色; 1 分,淡黄为弱阳性; 2分,深黄为中等阳性 ; 3分,棕色为强阳性。阳性细胞百 分率: 0分,为无阳性细胞; 1分,为阳性细胞 75%。两项之和: 0分为( - ) , 2分为( + ) , 34分为( + + ) , 57分 为( + + + ) (图2) 。 图2 VEGF、p53
10、和CEA 在胸水细胞中的表达 ( Env ision, 400) F ig. 2 Expression of VEGF, p53 and CEA in pleura effusion( Env ision, 400) A: Expression of VEGF; B: Exp ression of p53; C: Expression of CEA 1. 3 统计学方法 采用SPSS 11. 0软件分别作2检验及Fishers 精确检验,以P 0. 05为差异 有统计学意义。 2 结 果 2. 1 ICM对良恶性细胞中DNA含量的定性分析73例患者共进行了ICM检测68例, 13例良性疾 病患
11、者的胸腔积液,异倍体率仅占23. 1%。而临床诊断肺癌的 60例肺癌患者胸水中检测了55 例患者的胸水异倍体率占77. 8%, 两者有统计学差异( P = 0. 001) ,其中,以非小细胞肺癌 (NSCLC)的胸水异倍体率较高为80. 8% ( P = 0. 002) ,鳞、腺癌间无显著差异(表1) 。DNA 定 量分析能客观地判断良恶性胸水, 尤其是非小细胞肺癌的恶性胸水。DNA倍体灵敏度77. 8% ( 42 /55 ) ,特异度76. 9%(10 /13) ,阳性预测值( PPV)为93. 3% ( 42 /45) ,阴性预测值(NPV)为43.5% (10 /23) ,符合率77.
12、6%(52 /73) 。 表1 DNA含量在良恶性胸腔积液中表达 Table 1 Expression of DNA con ten t in pleura flu ids of d ifferen t or ig in s n (%) DNA dip loidy DNA aneup loidy P value Benign 10 (76. 9) 3 (23. 1)Lung cancer 13 (22. 2) 42 (77. 8) 0. 001 SCLC 4 (100) 0 NSCLC 9 (17. 6) 42 (80. 8) 0. 002Squamous 1 (50. 0) 1 (50. 0
13、) Non2squamous 8 (16. 3) 41 (83. 7) 0. 325 SCLC: Small cell lung cancer; NSCLC: Non2small cell lurg cancer 2. 2 胸腔积液的免疫组化检测 检测VEGF、p53、CEA。13例良性疾病患者胸腔积液中检 测8例,表达率分别为12. 5% , 0, 0。60例肺癌患者胸腔积液中检测 57 例, 表达率分别为17. 5% , 17. 5%和68. 4% ( 表2) ,良恶性胸腔积液中CEA的表达有显著差异( P 0. 001) ,VEGF和p53的表 达无统计学意义( P = 0. 671,
14、P = 0. 211) 。 表2 VEGF、p53、CEA 在良恶性胸腔积液中表达 Table 2 Expression of VEGF, p53 and CEA in pleura flu ids of d ifferen t or ig in s n (%) Exp ression Benign Malignant P value VEGF - 7 (87. 5) 47 (82. 5) 65 + 1 (12. 5) 10 (17. 5) 0. 722 p53 - 8 (100) 47 (82. 5) 65 + 0 10 (17. 5) 0. 198 CEA - 8 (100) 18 (31
15、. 6) 65 + 0 39 (68. 4) 0. 001 DNA combined biomarkers 60 - 7 (87. 5) 5 (9. 5) + 1 (12. 5) 47 (90. 4) 0. 001 2. 3 胸腔积液中DNA倍体与肿瘤标记物联合检测 60 例患者全部检测 DNA 倍体、 VEGF、p53 和CEA,良恶性胸腔积液经DNA 倍体联合VEGF、p53及CEA检测有统计学意义( P 0. 001) 。平行试验(4项指标中任何一项阳性即为阳性)的敏感率可达90. 4% (47 /52) ,特异度 87. 5% (7 /8) ,符合率 90%(54 /60) 。 3 讨
16、 论 目前肺部肿瘤的发生率在不断提高,鉴别良恶性胸腔积液是临床工作中常见问题。诊断 肺癌的金指标是组织、细胞学的病理诊断。但这是人为地把连续演变的肿瘤细胞分成良性, 交界性和恶性,往往带有一定的主观倾向性。而且常因细胞数太少或细胞形态问题出现“核 异型”等,不能作出肯定的诊断,给临床诊疗带来困难。1994年就有利用流式细胞分析( FCM) 进行胸腔积液脱落细胞DNA定量分析 ,鉴别良恶性胸腔积液 3 。在正常细胞中DNA 的含量是 恒定的,人正常细胞是二倍体,恶性细胞在多数情况下染色体数增加,其DNA含量也增加,称为 异倍体。根据这个特点,测定DNA 含量可作为诊断癌细胞的客观依据。当前国际上
17、已利用图 像处理系统( IAS)和图像细胞系统客观地从微观水平来诊断。其中, ICM可用来测定细胞经 染色后的光密度进行DNA 分析 4 。FCM作DNA 检测主要把肿瘤组织制成单个细胞悬液后 才能加以测量,这种悬液中常包含许多非肿瘤成分,如间质细胞、血管内皮及白细胞等;还由 于分离不彻底以致可能含多个细胞的细胞团或分离过度而产生核的碎片等。在分离过程中 不能对成分进行选择,因此会影响测量结果的准确性。ICM的特点是在光镜观察下可以选择 细胞,这样就可以摒除那些非肿瘤细胞或其他会影响结果的成分,而且即使细胞的量很少也能 测量 1 。 据报道 5 :痰DNA异倍体作为标志物诊断肺癌,异倍体阳性率
18、达40% ,与结核对照组、健康人 对照组有显著差异,而且高于常规痰脱落细胞学检查。本研究证实利用ICM检测DNA含量异 倍体阳性率在良恶性胸腔积液中有显著差( P = 0. 001) 。DNA倍体灵敏度77. 8%,特异度76. 9%, 阳性预测值( PPV) 为93. 3%,阴性预测值 (NPV)为43. 5%,符合率 77.6%。尤其诊断非小细胞肺癌 的癌性胸水更准确,因小细胞肺癌的胸水部分原因是因肿大淋巴结压迫,以致淋巴回流障碍所 致,而非肿瘤侵犯胸膜所致。VEGF是一种具有内皮细胞特异性的有丝分裂原,对血管生成有 强烈诱导作用。VEGF在肺癌胸膜转移导致恶性胸腔积液生成具有重要的作用。
19、但是免疫组 化VEGF半定量检测在胸水细胞中的表达较低,在良恶性胸水中均有表达,分别为12. 5%, 17.5%, 对鉴别良恶性胸腔积液作用有限。Thiekett等 6 采用EL ISA定量研究不同病因胸水中的 VEGF含量发现癌性胸水中VEGF含量明显高于非癌性胸水,与本研究不一致。可能因本研究 样本量较少并检测方法不同,未能体现VEGF表达在良恶性胸水鉴别的价值,与Kaya等 7 的检 查结果相似。p53 基因突变存在于各种实体瘤细胞中, 约50%的肺癌组织中可检测到p53基 因突变。但胸水细胞中的p53基因突变其阳性率仅17. 5% , 与张贺龙等 8 的研究结果相似。虽 然鉴别良恶性胸
20、水在统计学上没有意义,但可以看到良性胸水无表达,可以作为恶性胸水的筛 选。CEA作为癌胚抗原在良性胸水中无表达,而恶性胸水表达率达68. 4%,在鉴别良恶性胸水 有统计学意义( P 0. 001) 。通过ICM对胸水细胞的DNA检测联合VEGF、P53 和CEA的检测, 敏感率可达90. 4%,特异度87.5%,与常规胸水脱落细胞学检查相比 ,符合率达90%。值得进一 步探讨,有可能成为鉴别良恶性胸腔积液的又一方法。 第2期. 周 箴,等. 胸水脱落细胞DNA含量及VEGF, P53和CEA表达在良恶性胸腔积液鉴别中的意义157 J . Proc N atl Acad Sci USA, 200
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