1、膜片钳技术的发展与应用 崔梦梦 （生命科学学院 1241410026） 摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记 录单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到 0.06pA 的电流，它具有 1um 的空间分 辨率和 10us 的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究 离子通道的“金标准” 。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对 其电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技 术与其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细 胞生物学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。 关键
2、词：膜片钳；离子通道；发展与应用 在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以 及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理 技术被发明创造。英国学者 Huxley 和 Katz 最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电 流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道， 因而不能测定单一离子通道电流。所以在 1976 年德国神经生物学家 Erwin Neher 和 Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。 随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该
3、技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、 心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃 了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 一、膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相 接的膜仅含13个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此 在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道 开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到 单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻
4、封接可达到10亿欧，因 而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。 二、膜片钳技术的改进与新进展 （ 一 ） 穿 孔 膜 片 钳 技 术 1988 年 Horn 等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些 抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封 接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为 0.40.8 nm，可以选择性地通透 Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳 定，电流的衰减现象减弱。并且抗生素对细胞的损伤作用小，高阻封接不易被破坏，记录 的持续时间延长。 这种技术需
5、要在避光条件下配制含有抗生素的穿孔液，配好后于 4避光保存。充灌 电极时， 先用不含抗生素的电极液充灌，然后再加入含有抗生素的电极液反向充灌电极。 在这个过程中，应快速形成高阻封接，避免抗生素扩散到电极尖端抑制高阻封接的形成。 （ 二 ） 在 体 膜 片 钳 技 术 在 体 全 细 胞 记 录 膜 片 钳 开 始 于 研 究 感 觉 系 统 对 外 界 刺 激 的 反 应 特 性 和 机 理 ， 因 为 这 在 离 体 标 本 上 几 乎 是 无 法 实 现 的 。 早 期 研 究 感 觉 系 统 的 活 体 动 物 实 验 大 多 使 用 细 胞 外 记 录 方 法 ， 这 可 以 研 究
6、细 胞 对 自 然 刺 激 如 光 ， 声 音 等 的 反 应 特 性 和 规 律 ， 但 不 能 涉 及 感 觉 信 息 处 理 的 机 制 。 这 是 因 为 细 胞 外 单 细 胞 记 录 只 能 得 到 一 个 细 胞 的 最 终 输 出 ， 即 动 作 电 位 ， 而 不 能 获 得 其 突 触 电 位 的 波 形 ， 也 忽 略 了 所 有 的 阈 下 反 应 。 早 期 膜 片 钳 记 录 的 标 本 大 多 为 急 性 分 离 的 细 胞 ， 到 20 世 纪 80 年 代 末 ， 脑 片 全 细 胞 膜 片 钳 技 术 出 现 ， 20 世 纪 90 年 代 一 些 实 验
7、室 在 借 鉴 脑 片 膜 片 钳 技 术 的 基 础 上 ， 尝 试 在 整 体 动 物 ( 一 般 是 麻 醉 状 态 ) 上 进 行 膜 片 钳 记 录 。 最 早 的 报 道 是 Pei 等 在 德 国 马 普 研 究 所 的 工 作 。 他 们 通 过 对 成 年 猫 视 皮 层 神 经 元 进 行 全 细 胞 记 录 ， 然 后 观 察 来 自 不 同 方 向 的 光 刺 激 所 对 应 的 突 触 后 电 流 反 应 ， 以 此 探 讨 视 觉 信 号 传 递 和 形 成 机 制 ， 以 及 视 皮 层 神 经 元 功 能 和 结 构 的 关 系 。 但 可 能 是 由 于 电
8、极 与 细 胞 膜 的 封 接 不 够 好 ， 记 录 到 的 细 胞 静 息 膜 电 位 绝 对 值 较 小 ， 动 作 电 位 的 幅 度 也 比 正 常 值 低 很 多 。 随 后 许 多 国 家 都 开 始 了 对 在 体 膜 片 钳 技 术 的 研 究 。 目 前 该 技 术 越 来 越 成 熟 ， 记 录 到 的 反 应 也 越 来 越 符 合 实 际 。 （ 三 ） 全 自 动 膜 片 钳 技 术 传 统 膜 片 钳 技 术 每 次 只 能 记 录 一 个 细 胞 （ 或 一 对 细 胞 ） ， 对 实 验 人 员 来 说 是 一 项 耗 时 耗 力 的 工 作 ， 它 不 适
9、在 药 物 开 发 初 期 和 中 期 进 行 大 量 化 合 物 的 筛 选 ， 也 不 适 合 需 要 记 录 大 量 细 胞 的 基 础 实 验 研 究 ， 全 自 动 膜 片 钳 技 术 的 出 现 在 很 大 程 度 上 解 决 了 这 些 问 题 。 全 自 动 膜 片 钳 技 术 是 离 子 通 道 检 测 的 新 技 术 ， 它 具 有 直 接 性 、 高 信 息 量 及 高 精 确 性 的 特 点 。 与 传 统 的 膜 片 钳 技 术 相 比 ， 它 主 要 具 有 以 下 优 点 ： 效 率 高 ， 是 传 统 膜 片 钳 效 率 的 20300 倍 ； 不 需 要 专
10、业 电 生 理 人 员 ， 简 单 易 用 ， 所 有 的 操 作 可 以 在 电 脑 软 件 控 制 的 界 面 下 完 成 ， 无 须 显 微 防 震 系 统 ； 大 部 分 仪 器 的 封 接 质 量 在 1G 欧 以 上 ； 部 分 仪 器 同 时 适 用 于 研 究 配 体 门 控 通 道 和 电 压 门 控 通 道 ； 主 要 应 用 于 药 物 药 理 和 毒 理 测 试 ； 在 药 物 微 量 加 样 设 计 方 面 表 现 优 秀 ； 仪 器 主 要 工 作 方 式 为 全 细 胞 膜 片 钳 方 式 。 随 着 基 因 组 测 序 的 完 成 和 蛋 白 质 组 学 的 兴
11、 起 ， 离 子 通 道 在 未 来 的 细 胞 与 药 物 方 面 研 究 将 会 变 得 越 来 越 重 要 。 与 此 同 时 ， 作 为 离 子 通 道 研 究 的 最 佳 伴 侣 全 自 动 膜 片 钳 技 术 将 会 越 来 越 重 要 ， 而 且 其 应 用 领 域 也 将 越 来 越 大 。 三 、 膜 片 钳 技 术 的 应 用 （ 一 ） 在 心 脏 电 生 理 方 面 的 应 用 人 类 心 脏 主 要 存 在 Na+通 道 、 K+通 道 等 主 要 的 离 子 通 道 。 心 脏 的 自 发 节 律 性 是 受 心 肌 细 胞 的 电 活 动 控 制 的 ， 而 心
12、肌 电 活 动 的 基 础 便 是 心 肌 细 胞 的 各 种 离 子 电 流 的 变 化 。 因 此 膜 片 钳 技 术 可 以 用 来 分 析 心 肌 静 息 电 位 及 其 自 发 去 极 化 的 机 制 ， 对 钠 、 钾 、 钙 和 乙 酰 胆 碱 通 道 的 调 控 机 制 进 行 更 深 入 的 了 解 。 此 外 ， 膜 片 钳 技 术 也 可 以 用 来 分 析 心 脏 在 病 理 状 态 下 引 起 通 道 活 性 和 受 体 功 能 改 变 ， 从 而 可 以 从 根 本 上 对 各 种 心 脏 病 进 行 诊 断 和 治 疗 。 （ 二 ） 在 血 管 研 究 中 的
13、应 用 研 究 发 现 血 管 平 滑 肌 细 胞 的 凋 亡 与 K+通 道 活 动 增 加 有 关 ， 在 动 脉 粥 样 硬 化 发 生 与 发 展 过 程 中 ， 电 导 型 钙 激 活 钾 通 道 起 着 重 要 的 功 能 作 用 。 某 些 药 物 影 响 动 脉 粥 样 硬 化 血 管 平 滑 肌 细 胞 离 子 通 道 而 发 挥 作 用 。 膜 片 钳 技 术 给 动 脉 粥 样 硬 化 发 病 机 理 研 究 带 来 了 新 的 亮 点 。 Wiecha 等 应 用 膜 片 钳 技 术 对 冠 状 As 斑 块 平 滑 肌 细 胞 与 正 常 冠 状 动 脉 平 滑 肌
14、细 胞 的 特 性 进 行 了 比 较 研 究 。 结 果 表 明 冠 状 As 斑 块 平 滑 肌 细 胞 BKCa 比 正 常 冠 状 动 脉 平 滑 肌 细 胞 BKCa 有 较 高 的 通 道 活 性 。 这 一 发 现 意 味 着 BKCa 通 道 在 动 脉 粥 样 硬 化 的 发 生 与 发 展 中 起 着 重 要 的 功 能 作 用 。 (三 )在 神 经 科 学 中 的 应 用 应 用 膜 片 钳 技 术 可 以 研 究 神 经 信 号 的 产 生 和 传 导 。 由 于 中 枢 神 经 系 统 的 脆 弱 性 和 难 以 接 近 性 ， 研 究 脑 的 网 络 特 性 及
15、其 复 杂 的 调 控 功 能 是 十 分 困 难 的 。 在 具 有 简 单 网 络 系 统 的 离 体 脑 片 上 应 用 膜 片 钳 技 术 ， 为 这 一 方 面 的 深 入 研 究 开 辟 了 一 个 崭 新 的 领 域 。 目 前 将 膜 片 钳 技 术 应 用 到 神 经 系 统 的 研 究 是 不 少 的 。 但 主 要 侧 重 于 用 膜 片 钳 技 术 观 察 不 同 部 位 细 胞 形 态 学 和 电 生 理 特 性 的 研 究 ； 各 种 化 学 药 物 的 作 用 对 神 经 系 统 影 响 的 研 究 ； 适 于 膜 片 钳 技 术 研 究 的 细 胞 的 制 备
16、及 分 离 方 法 。 （ 四 ） 在 药 理 学 中 的 应 用 药 物 研 制 的 关 键 在 于 探 测 药 物 作 用 的 靶 点 。 在 药 物 筛 选 中 ， 将 目 的 药 剂 以 吹 打 或 灌 注 方 式 直 接 施 加 于 培 养 细 胞 。 借 助 特 定 离 子 通 道 阻 断 剂 ， 利 用 膜 片 钳 方 可 迅 速 判 明 药 物 作 用 及 作 用 方 式 等 问 题 。 因 此 ， 膜 片 钳 对 于 药 品 的 研 制 、 生 产 都 有 着 十 分 巨 大 的 促 进 作 用 。 制 药 企 业 还 可 以 利 用 当 前 新 兴 药 物 虚 拟 筛 选
17、技 术 进 行 初 筛 ， 把 初 筛 结 果 再 结 合 全 自 动 膜 片 钳 技 术 进 行 实 验 上 的 验 证 。 虚 拟 筛 选 的 目 的 是 从 数 十 万 到 数 百 万 化 合 物 库 中 筛 选 出 可 能 的 小 分 子 化 合 物 ， 再 进 一 步 进 行 实 验 研 究 。 把 全 自 动 膜 片 钳 技 术 结 合 以 离 子 通 道 为 靶 标 的 高 通 量 虚 拟 筛 选 研 究 技 术 ， 无 疑 将 会 极 大 的 缩 短 研 究 时 间 和 节 省 大 量 的 研 究 经 费 。 除 此 之 外 ， 膜 片 钳 技 术 还 可 以 应 用 于 胃
18、肠 道 研 究 、 信 息 传 递 、 中 药 理 论 等 多 个 理 论 中 。 总之膜片钳技术以其实用、快速、灵敏、准确及重复性好等技术优势已经在大量的 研究中得到证实。膜片钳技术为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透 性、选择性等膜信息，提供了最直接的手段，使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个 崭新的阶段。 四、膜片钳技术与其他技术的结合 随着科学的发展，越来越多的研究需要多种技术的配合运作。虽然膜片钳技术有很强 的记录分析功能，单纯应用仍远不足以研究、解释生命活动的许多现象。因此，出现了与 其它技术的结合运用。 （一）膜片钳技术与分子生物学技术的结合 分子生物学是从分子
19、水平上研究生物的形态结构及其功能的科学，膜片钳技术利用微 电极来研究细胞膜上离子通道的通透性和电位的变化，二者之间的结合，可以将神经细胞 离子通道的结构特性和物理特性展现出来。同时，可在同一细胞中分离提取特异性表达的 mRNA。用膜片钳进行全细胞记录的同时，收集细胞胞浆，然后将mRNA反转录成cDNA，并进 行PCR扩增，将PCR产物通过凝胶电泳和DNA序列进行分析。再用特异性引物来区别离子通道 亚单位，揭示神经细胞结构和功能的关系，从基因水平研究神经传导通路，提高对神经系 统本质的认识。 （二）膜片钳技术与荧光技术的结合 一些荧光探针常用于检测细胞内的钙离子浓度，它们能与钙离子结合，产生较强
20、的荧 光，通过膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度，钙离子的 释放及内流等情况，研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。 （三）膜片钳技术与碳纤电极局部电化学微量检测技术的结合 如果给碳纤电极一个适当的稳定的电压，使接近或吸附到碳纤电极表面的某些物质发 生氧化反应而释放出电子，碳纤电极可俘获这些电子，而电子流过电极产生电流，因此根 据所控测部位或培养细胞中某物质氧化时所产生电流的不同，可判别分泌物(被探测物)的 种类，并根据电流总量的大小，计算出该物质的分泌量。1992年，Neher实验室首次将膜片 钳膜电容检测与碳纤电极联合运用；1994年又将光电联
21、合检测与碳纤电极局部电化学微量 检测技术结合，既能研究分泌机制，又能鉴别分泌物质。 总之，随着膜片钳技术的进一步完善以及与其他先进技术的结合，使其应用领域越来 越广泛，相信随着研究的深入，其在生命科学领域中的应用将会大放异彩。 五、对膜片钳技术的展望 膜片钳技术自建立以来，不断的发展完善，对生命科学的研究做出了巨大的促进作用。 对该技术的应用已经涉及到神经科学、心血管科学、药理学等多个领域。在体膜片钳技术 与全自动膜片钳技术的发展使神经科学以及多细胞的研究等领域展开了新的局面。同时随 着科学技术的发展与进步，使得膜片钳技术与其他先进的研究技术相结合，从而将膜片钳 技术的应用带入到另一个高峰，在
22、生命科学的研究领域中得到更广泛的应用。 随着膜片钳技术在生命科学领域的大放异彩，个个研究机构都开始对膜片钳技术进行 或多或少的研究，并且将其应用到各个不同的领域，使膜片钳技术得到了更充分的发展与 应用。相信在不久的将来，膜片钳技术必将为生命科学的发展做出更重要的贡献。 参考文献 【1】 曹建斌. 膜片钳技术的发展及其应用. 运城学院学报. 2009年4月,第27卷第2期：5355 【2】 曹小于、郑婉云、鲁燕滨、黄超. 离子通道研究技术的最新进展全自动膜片钳技术 仪器评介. 2007年第二期：4749 【3】 田晶. 膜片钳技术的应用进展. 吉林医药学院学报. 2008年08月,第29卷第4期
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