1、4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制 备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整 的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏 是一项重要的基础工作。 4.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是 CMCC(F)或 CMCC(B)，CMCC-中国医学菌种 保藏中心， 、 ，B代表细菌， F代表真菌。 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠杆菌 CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63501 白色念珠菌 CMCC(F)98001 黑曲霉 CMCC(F
2、)98003 4.3 传代和接种 4.3.1 菌种冻干粉复苏 4.3.1.1 把冻干菌种管、灭菌 1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面 数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用 75%酒精擦 洗消毒，稍干，用 75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封 口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端， 是骤冷而炸裂。 4.3.1.3 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌 滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动
3、促使溶解，随即吸出 管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将 已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2 菌种斜面传代操作 4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名 及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约 30 分钟，待温度平衡后再移入接种 室或超净工作台。 4.3.2.2 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端， 将接种环烧红 30 秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过 3 次。左手将管 口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将
4、接种环深入管内 先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环， 并将菌种管口移至火焰旁。 4.3.2.3 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞， 将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使 细菌划在斜面的表面上。 4.3.2.4 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火 焰上烧灼灭菌。4.4 菌种的培养与保存 4.4.1 大肠杆菌 35-37 摄氏度培养 48 小时 金黄色葡萄球菌 30-35 摄氏度培养 48 小时 枯草芽孢杆菌 30-35 摄氏度培养 48 小时 白
5、色念珠菌 23-28 摄氏度培养 7 天 黑 曲霉 23-28 摄氏度培养 7 天 4.4.2 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（ 2-8 摄氏度）保存，一般 2 个月转种一 次。 4.5 菌悬液的制备 4.5.1 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌 苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌） ，将已接种毕的细菌管置 35-37 摄氏度培养 18-24 小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。 4.5.2 取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液 混匀，为 10-1，再取另一只刻度吸管吸取 10-1 菌液 1m
6、l 加到 9ml0.9%无菌氯化钠溶液中混 匀，为 10-2以此类推，稀释至含活菌数在 50-100 个。用平板计数。 4.5.3 此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在一周内使用。 4.7 记录 4.7.1 传代和接种使用后，应做好菌种传代接种记录 。 4.7.2 菌悬液制备后，应做好菌液制备使用记录 。 依据: 中国药典 2010 年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0 代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面 （3 代） 。黑曲霉的 0
7、代菌种为保存于含 15%甘油的 0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷 存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 CMCC（B ）代表细菌（bacteria ）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随 菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在 相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种 安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、 贮存条件
8、、有效期至。新购入的 0 代原始菌种储存于20，有效期为三年。从上级药检 部门购买的已接种好的菌种斜面（3 代）应检查菌种管是否完好。储存于 28 ，有效期 为 3 个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球 3.2 培养基 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮 . 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮 . 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门 菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮 . 3.3 操作步骤： a.打
9、开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心， 因为安瓿遇热时可能会破裂） 。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.50.8 ml 到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度 3035，培养 1824 小时；真菌培养温度 2328，培养 35 天。观察是否浑浊，浑 浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养
10、时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体 12 滴滴在改良马 丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置 2328培养 57 天，斜面正面为黑褐色厚绒状， 色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有 0.05%（ ml/ml）的吐温-80 的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。 i.取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培养基中按 g 项操作对菌种进行复壮。以 无菌技术向复壮后的菌种中加入 100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/ 管分装于冻存管。每个 菌种制备 1
11、0 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。 其余作为储备管。黑曲霉的 h 项下洗脱液按 h 项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入 20ml 、30% 的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻 存管。制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确 认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种 代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 j储备菌种管制备成功，储存于20，有效期为三年。 3.4 菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到
12、营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于 该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在 3035下培养 23 天；同样 的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在 2328下培养 7 天；培养后，观察其菌 落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5 污染处理 假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染 了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新 制备储备菌种管 3.6 菌种的传代与保藏 将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转 至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种
13、为第 0 代， 冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第 1 代，直到第 3 代为工作菌种。菌种的传代次数 （自原始菌种冻干粉起）不得超过 5 代。 菌种的传代保藏过程 3.3 项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传第三代时取 1 支冻存管自然解 冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第 3 代。工作用菌种，分为 两类：一类用于定期传代(W3) ，一类用于实验用（S3） 。 定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）： （1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约 30 分钟。 （2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一 并移入洁净
14、工作台，打开紫外灯照射一小时。 （3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接 种棒后端，将接种环烧红约 30 秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。 （4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻 轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取 少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。 （5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支， 照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部 向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端
15、，使细菌接种在斜面的表面上。 （6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火 焰上烧灼灭菌。 （7）将已接种好的细菌管置 3035细菌培养箱培养 22 24h，真菌管置 2328 真菌培养箱最多培养 7 天。 当工作用菌种传代代数小于 5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种， 如：（W3）可直接转接为（W4） 。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重 新接种，旧的工作菌种进行销毁。 菌种斜面的培养、保藏条件及时间 注：菌种斜面 1 次/周观察状态是否正常。 3.7 菌种的使用及销毁 每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时
16、，应对所用物品重新 消毒灭菌。 每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、 代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。 废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121 高压蒸汽灭菌 30 分钟。并对操作过程进行 菌种 培养条件及时间 培养基 保存条件及时间 大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 30352224h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 30352224h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 30352224h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 铜
17、绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 30352224h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 30352224h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 生孢梭菌(CMCC(B)64941) 30352224h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 白色念珠菌 (CMCC(F)98001) 2328 最多 7 天 改良马丁琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 黑曲霉(CMCC(F)98003) 2328 最多 7 天 改良马丁琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 记录。
