1、实验三：学习细菌培养的基本技术 实验原理：要根据微生物的营养需要，采用相应的配方配制培养基。 培养基除满足微生物所需各种营养外，还要适宜的 pH 值。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养 基应用广泛，适于多种细菌的培养。 配置好的培养基必须经过灭菌，一般采用高压蒸汽灭菌。在整个细菌接种培养过程中，一般 要求无菌操作。 方法步骤： 一、培养基的配制 称量 溶化 调 pH 值 培养基的分装 加棉塞 包扎 加水加热 边滴边搅拌 趁热分装 棉塞长度 2/3 在内 外加牛皮纸 随时用测 pH 值 培养基高度为 1/5 挂上标签 二、灭菌 高压蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。 灭菌原理:依据高压升温使菌体细胞蛋白
2、质凝固变性失去生命力,将 0.11MPa、 121oC,维持 30min 彻底灭菌 操作：加水、装料 加热、排气 升压、保压 降压、排气 加开水适当,试管 打开排气阀, 加热至沸腾 压力至 0.11MPa,T 为 121oC 压力降至 0, 口向上,不能太挤 排气 510min,关闭 控制热源，保压 30min T100oC 开阀 三、搁置斜面 当 T 接近 50oC，将试管摆在一根木棒上。培养基形成的斜面不超过试管总长度的一半。 四、接种 微生物接种的各项操作要求必须在无菌条件下进行。 设备的准备和消毒： 设备：无菌操作箱(无条件可直接在在酒精灯上 )，接种环 双手 75酒精消毒 熏蒸法或紫
3、外灯灭菌 灼烧法消毒 采菌：点燃酒精灯用左手并排拿起有菌种的试管和培养试管靠近酒精灯火焰, 旋松棉塞 右手拿 接种环,在火焰上烧红灭菌取下棉塞，并灼烧试管口一周接种环伸入试管，挑去少量菌体，立即抽出 接种：迅速将接种环插入培养试管中在斜面上由管底向管口连续轻划几道蛇形曲线 （画线要求：线要划密一些,不要划破培养基,不要使接种环接触到管壁或管口,不重复划） 及时抽出接种环 将试管口在火焰上灼烧，塞上棉塞 熄灭酒精灯,菌种加热倒掉 五、保温培养 接种后，试管放在保温箱中，25 oC 下培养 5 7 天(37 oC 下培养 24h) 练习： 一、选择题 1、下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ）
4、 A、防止杂菌污染 B、消灭杂菌 C、培养基和发酵设备都必须灭菌 D、灭菌必须在接种 前 2、制作细菌培养基时，pH 值应调为（ ） A、4.56 B、7.4 7.6 C、7.88 D、2 4 3、下面的资料表明在各种培养基中细菌的生长（S 、C、M 为简单培养基，U、V 、X、Y、Z 代表加入培 养基的不同物质） ，问哪一些物质细菌不能合成（ ） 培养基 S、 C、 M S、 C、 M+V+ S、 C、 M+U+ S、 C、 M+Z+ S、 C、 M+V+ S、 C、 M+U+ S、 C、 M+Y+ 棉塞能防止杂菌污 染,保证通气良好 Z Y X Y X Z 生长状况 A、U B、V C、Y
5、 D、Z 4、细菌培养基常在 121o C 压力锅中灭菌，如果只是在 100oC 的温度下降细菌培养基灭菌，以下哪一种 生物仍会存活（ ） A、大肠杆菌 B、一种青霉 C、枯草芽孢杆菌 D、沙门氏菌 5、下列操作与灭菌无关的是（ ） A、接种前用火焰灼烧接种环 B、接种前用酒精擦拭双手 C、培养基在 50oC 时搁置斜面 D、接种在酒精灯的火焰旁完成 6、培养基分装完毕以后，在管口上加一棉塞，下图中哪种加棉塞的操作是正确的（ ） 7、在用高压蒸汽锅灭菌时，其灭菌的正常压力为（ ） A、49KPa B、98KPa C、9800KPa D、9.8KPa 8、高温灭菌的原理是（ ） A、每种微生物生
6、长的最适温度是一定的 B、微生物对于高温环境部适应 C、高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动 D、高温降低了环境中氧的浓度 9、在培养基的配制过程中，下列哪项操作是不正确的（ ） A、趁热降培养基分装到洁净的试管中，培养基高度为试管长度的 1/5 B、在溶化过程的最后要补加蒸馏水至 100mL C、在调 pH 值时要随时用 pH 试纸测 pH D、试管加塞后，每 10 支用绳扎捆，在试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名， 就可以进行灭菌 10、在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是（ ） 用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上
7、成水平状态 右手拧送棉塞，但不取下 在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞，将它们取下，同时左腕转动，烧灼管口一周。 将接种环伸入管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少量菌体，立即将 接种环抽出。 右手拿接种环，在火焰上灼烧灭菌。 在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到培养基的底部，由里向外轻轻画蛇形细线。 抽出接种环，再用火焰烧灼管口，并在火焰上方将棉塞塞上。 A、 B、 C、 D、 11、下列有关碳源的叙述不正确的是（ ） A、 碳源主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物 B、某些碳源可以作为微生物的主要能源物质 C、蛋白质一定不能做碳源 D、不同种类的微生物的碳源可
8、能不同 12、细菌数目上升的最快时期和活菌数目的高峰期分别是（ ） A、对数期、稳定期 B、稳定期、稳定期 C、对数期、对数期 D、稳定期、对数期 13、菌种鉴定的重要依据是（ ） A、细菌的大小、性状颜色 B、菌落的大小、形状、颜色 C、有无鞭毛 D、培养基的不 同 二、简答题 1、为使培养基呈固体状态，需要配置好的各营养液成分的液体里加入 ，溶化冷却即可。 调节培养基的 pH 值，用浓度为 1mol/L 的 或 溶液进行调节。 2、搁置斜面时培养基温度不能 ，否则培养基会变成 。应趁热将试管放置成斜 面形，使管内培养基形成斜面的长度不超过试管总长的 。 3、微生物接种时各项操作必须在 条件
9、下进行。因此必须在 中操作。接种环要在 上用灼烧法灭菌，双手用 的酒精消毒。接种时将灭菌的接种环挑去一点 ，迅 速插入培养基试管里，在斜面上由 向 连续划几道 线，然后将试管口在火焰 上灼烧，塞上 。接种后的试管要放入 箱中在 下培养，即可 见斜面上出现 。 4、关于水污染对生物的影响的实验如右图所示，将放置一天的洗碗水、河水、自来水各 5mL，分别注入 13 号试管中。再各滴加几滴 0.01%亚甲基蓝溶液。把上述试管在温暖环境中放置 40min 后，1 号试 管内水样由蓝色变为无色，2 号试管内水样变为浅蓝色，3 号试管内水样 的颜色无变化。请回答： （1）在 1 号、2 号试管内水样中大量
10、繁殖的生物是 。 （2）上述生物的数量与水样中的 含量成正比。 （3）1 号、2 号试管内水样变色的原因是 。 5、以下是一个证明食物腐败是由细菌引起的实验，阅读材料和图示，回答相关的问题。 把碎肉或大豆加水煮烂，用两次纱布滤取肉（豆）汤备用。 在 3 只三角烧瓶里各注入 50mL 肉（豆）汤。第 1 个瓶不 同瓶塞，第 2 个瓶用药棉塞紧，第 3 个瓶用紧有 S 形弯玻 管的药棉塞塞住（如下图） 。 把 3 只烧瓶放入盛水的锅子里隔水加热，使锅子里的水沸 腾 5min。取出 3 只三角烧瓶，冷却后放在温暖的阴暗处 （日平均温度在 20oC 以上） 以后，逐天观察肉（豆）汤的变化。结果，一天后
11、，不加塞烧瓶里的肉汤已浑浊，液面有一层薄膜， 这是细菌的群体，叫做菌落。瓶内可以有臭味，说明肉汤已腐败。加药棉瓶塞烧瓶的肉汤几天后也开 始腐败。加药棉塞和 S 型玻管的烧瓶维持时间最长，但肉汤也将终将腐败。 （1）本实验采用的是什么实验法？ （2）不加塞的瓶内肉汤为什么会腐败？ （3）加药棉瓶塞烧瓶内的肉汤几天为什么也开始腐败？ （4）实验操作的第步是起 作用。 答案： 一、选择题 1、B 2、B 3、C 4、C 5、C 6、A 7、D 8、B 9、B 10、C 11、C 12、A 13、B 二、简答题 1、琼脂 NaOH HCl 2、太低 固定 1/2 3、无菌 无菌箱 酒精灯 75 菌落 管底 管口 曲 棉塞 恒温 25 57 菌落 4、 （1）好氧细菌 （2）有机物 （3）好氧细菌氧化分解亚甲基蓝染料 5、 （1）对比实验法 （2）不加瓶塞的烧瓶直接接触空气，腐败细菌进入机会最多。肉汤有多种养分，在适宜的温度下，细 菌迅速繁殖，使汤液中有有机物腐败分解 （3）加有棉塞的烧瓶，细菌进入机会较少，但也很难防止细菌侵入，同时由于消毒不彻底，留在瓶内 的细菌芽孢可能发芽繁殖 （4）灭菌
