1、 选择性五羟色胺在摄取抑制剂（SSRI）氟西汀的情况下是否 影响贝紫贻贝？ Maria Gonzalez-Rey, Maria Joo Bebianno* CIMA，阿尔加维，法鲁， Gambelas 大学理学院和技术学院，8000-135 Faro，葡萄牙 文章历史：写作于 2012 年 5 月 23 日，修改至 2012 年 8 月 30 日，发布于 2012 年 10 月 10 日 关键词：紫贻贝，氟西汀，抗氧化酶，神经毒性作用，内分泌干扰 摘要：氟西汀（FLX）在活性药物成分的作用下，与水生环境息息相关，在污水处理厂系 统中，处方精神科药物被广泛使用，且去除率较差。API充当选择性血清
2、素再吸收抑制剂 （SSRI），经常被报道引起了非目标物种的破坏。这项研究的目标包括两周内暴露于 75ng 于贻贝紫贻贝多的生物标志物的反应评价中。以1 FLX评估抗氧化酶活性超氧化物歧化酶 （SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽-S- 转移酶（GST） ;过氧化脂质（LPO），通 过不稳定磷酸盐（ALP）的卵黄蛋白原样蛋白间接测量乙酰胆碱酯酶（AChE）神经毒性反 应和内分泌紊乱的过程。结果表明组织特异性酶促反应 和损害主要影响河蚌鳃。然而，在整个时间在两个性别分化的性腺明确ALP水平的抑制使 证据FLX增强行动的内分泌干扰物，而不是氧化或神经诱导 1.简介。 关联到水生生态系统的活性药物
3、成分（API）在生态毒性发生的风险中无处不在。随着检 测技术的进步，正在对水生环境中检测到一个更大的API（参见评论：卡利斯托和埃斯特 维斯，2009;Kmmerer ，2009; Li和Randak，2009;阿隆索等人，2010年;帕尔等人，2010年; Kmmerer，2010; Santos等，2010; Brausch 和Rand，2011）。污水处理厂仍然装备不良的 api，其排负荷去除率差，因此这些生物活性物质最终会通过家庭和医院污水处理进入地表 水（河流，河口和湖泊），并从那里回收到饮用水（恩斯，2001;恩斯等人，2002年; 的 Stackelberg等人，2004; Jo
4、nes等人，2007; Kim等人，2007; Daughton，2010）构成对非目标 水生生物的影响（2001年潜在的风险;布鲁克斯等人，2005年; FENT等，2006）。 氟西汀出现在抗抑郁药氟苯氧丙胺中被广泛使用（如西酞普兰，氟伏沙明，帕罗西汀，舍 曲林和）通过增加血清素作为选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI ）在治疗抑郁症和其他情 绪障碍（5-羟色胺5-HT ）等方面的手段，提高神经元突触间隙的水平（Brosen，1993;德 风向标，1999; Hiemke和Hrtter，2000; FENT等，2006）虽然， FLX作为尿液的不变母体化 合物百分之30排出体外，或代谢为去甲
5、氟西汀（德风向标，1999; Hiemke和Hrtter，2000; 芳和莫尔纳，2008年）是有弹性的水解，光解和微生物降解过程（权和安布拉斯特，2006 年）发生在1毫克的水生环境中（表1）。自从SSRIs改变神经递质5HT 调节之后，关联到了 脊椎动物和无脊椎动物（2001激素和神经机制重要功能调制; FENT等人，2006; Stanley等， 2007。画家等，2009;Styrishaveet等人，对FLX曝光生态毒理学效应2011）大多数评审专注 于急性毒性FLX和/或生理，行为变化（流动性，食性和侵略）和生殖健康的变化（表2）。 尽管如此，FLX还涉及影响抗氧化系统中的小鼠（D
6、jordjevic等，2011）。氧化的特征在于 不平衡的生物外源性介入活性氧（ROS），（如超氧化物阴离子（OH ），过氧化氢 （H2O2）和羟基自由基）使其超过暴露需氧生物抗氧化防御机制。一这些机制涉及反作用 于抗氧化酶，如反应 表1 氟西汀在水生环境浓度。 氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢（CAT）和还原型谷胱甘肽（过氧化物酶谷胱甘肽过氧 化物酶和还原酶GR）（利文斯通，2001; Regoli等，2002a ，B; Valavanidis等，2006）。 此外，二期谷胱甘肽S-转移酶还可以排毒，作为在结合反应谷胱甘肽与外源性的催化剂化 合物电中心（Regoli和Principato，1
7、995）。当抗氧化剂的系统响应由 ROS过量破坏，过氧 化脂质（LPO）产生，导致的磷脂膜的损伤（Valavanidis等人，2006）。抗氧化酶相似的 脂质产生波动。由于污染物曝光已成功地用作氧化应激和损伤的生物标记物在贻贝物种 （Regoli和Principato，1995; Regoli等，2002a; Santovito等人， 2005; Bebianno等人，2005）. 据我们所知，这是第一次研究FLX现实环境浓度的电位变化状态（75纳克L 1）暴露在贻贝 地中海贻贝通过抗氧化酶活性的评价：SOD，CAT;贻贝“鳃和消化腺二期GST活性， LPO。SSRI FLX可能造成神经毒性效
8、应响应通过评估一个基本神经传递调节剂的活性这一 指标，乙酰胆碱酯酶测试胆碱酯酶（AChE）的贻贝鳃。 AChE活性已经报道在几种有机污 染物的存在下（如杀虫剂，清洁剂和药品），以被抑制（Almeida等人，2010;鞋底等， 2010）。最后，碱不稳定磷酸盐（ALP）方法用于性别分化贻贝性腺评估FLX作为一种内 分泌干扰诱导剂，因为ALP水平与那些从卵黄蛋白原样蛋白这是在女性自然男性现象相关 （布莱斯等人，1999;加涅等人， 2002; Matozzo等人，2008）。 2.材料与方法 2.1。化学制品 R - （ - ）盐酸氟西汀（F1678，98，CAS：114247-09-5）; 1.
9、1.3.3。四甲（MDA ） （108383，CAS：102-52-3 ）;1- 甲基-2- 苯基吲哚（99，CAS 号：3558-24-5 ）; 5,50-二硫 代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）（D8130，？98TLC ， CAS：69-78-3 ）;乙酰基硫代胆 碱碘化（ATC）（A5751，98 TLC ，CAS：1866-15-5）;牛血清白蛋白（BSA） （A9418，98 ，CAS：9048-46-8）;丁基化羟基甲苯（BHT）（B1378，99.0GC，CAS 号：128-37-0）; 从马心脏细胞色素C （C7752， 95，CAS：9007-43-6 ）; 二乙烯三羧酸二
10、 酐（DTPA）（D6148，CAS：23911-26-4 ）; 乙二胺四乙酸（EDTA ）（ED，99，CAS号： 60-00-4）;菲斯克和Subbarow减速（F5428）;谷胱甘肽还原酶（G3664，CAS：9001-48-3 ）; HEPES（H3375 ， 99.5，CAS：7365-43-9 ）; 过氧化氢溶液（H1009，30w / w的， CAS：7722-84-1）;次黄嘌呤（H9377， 99，CAS：68-94-0）; L-谷胱甘肽氧化 （GSSG）（G4501， 98，CAS：27025-41-8）; L- 减少谷胱甘肽（GSH）（G4251 ， 98，CAS ：70
11、-18-8）;甲磺酸（ 99.5，CAS ：75-75-2）;的Triton X- 100（X6878，CAS：9002-93-1）从牛奶黄嘌呤氧化酶（X1875，CAS：9002-17-9）; B 烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸减少钠盐水合物（NADPH）（N8129，97CAS号：606-68-8）购自 Sigma Aldrich公司（德国） .Protein-测定染料试剂浓缩物（磷酸CAS购买：7664-38-2甲醇 CAS号： 67-56-1）从Bio-Rad实验室公司（USA）获得。1,4-二硫苏糖醇（DTT ） （99，CAS ： 3483-12-3）;乙腈（99.8，CAS 75-05-
12、8）;甲醇（99.9，CAS 67-56-1）; natriumazide（叠氮化钠）（106688，？99，CAS：26628-22-8）;氯化钾（氯化钾） （104936，99.5，CAS号：7447-40-7 ）; 三氯乙酸（TCA）（100807，CAS：76-03-9）;三 - （羟甲基）氨基甲烷（99， CAS号：77-86-1）购自默克公司（德国）获得的。 1氯- 2,4-，-dinitrobenzene（CDNB ）（24440，98.0GC ，CAS ：97-00-7）;钼酸试剂溶液 （puriss PA）和磷酸二氢钾（60218，自Fluka 收购7778-77-0）：99
13、.5，CAS。 D（TH） 蔗糖额外纯（16104，99，CAS：57-50-1 ）; 氯化钠（盐）（puriss PA，CAS：7647-14- 5）;钠氢氧化钠（NaOH ）（纯化的， CAS：1310-73-2）自Riedel-脱HAEN 得到（德国）。 2.2。氟西汀曝光法 贻贝地中海贻贝（N245，平均壳长尺寸： 672毫米，宽度：371毫米），收集在2010年从 河口Formosa湖中Portugal.These 标本运送活到实验室，受到壳清洗最后放置在单独的关于控 制和治疗接触75纳克L 1 FLX的水族箱（N35 ，1贻贝L 1）中。此前的75纳克L 1 FLX暴 露所有贻贝都
14、保留7天在的充气天然海水。在水族箱保持在恒定的温度（18.64 C1），盐度 （33 0.4），pH值（8.1 0.2）和氧饱和度（ 98 2）。贻贝未被医送，直到实验结束。水 被改变使FLX浓度每48小时重新建立。 在每个设置的时间（0，3,7，和15天），贻贝（正20）从除去控制和曝光水族馆，个体壳 生物数据测量（长度，宽度），并进行解剖，分离鳃，消化腺和性腺。每组织样品立即冷 冻在液氮中并单独存储80C状态分析。对于条件指数（ CI）估计，每15个贻贝水族馆，其 中个别的加权有关的比例（式（1）。）： 2.3。组织准备抗氧化酶活性分析 采用抗氧化酶的分析进行解剖以前鳃（正5）和消化腺（正
15、5）分开。每个单独的组织用 20mM TRIS缓冲液（含有蔗糖0.15M氯化钾1mMof DTT EDTA0.5 M的1毫摩尔）在 pH7.6。匀浆物离心15分钟，在 500？在4克4 C和得到的上清液离心分离45分钟a在4C g。后 胞浆部分体积测量，葡聚糖 G-25凝胶柱施加以进一步纯化样品中除去低分子量蛋白质。 之前的100毫升的等分试样，将总的纯化使用如根据标准的牛血清白蛋白（BSA）蛋白质定 量布拉德福德的方法（布拉德福德，1976年）。 鳃和消化腺的纯化等分单独一式三份的若干抗氧化酶通过分光光度分析应用以下方法进行 定量分析。为了确定在贻贝组织的SOD活性，各100毫升纯化的等分试
16、样进行评价，根据麦 科德和Fridovich（1969）的方法测定了50的细胞色素c的吸收减少，在由黄嘌呤氧化酶/ 次黄嘌呤系统产生550nm的波长。 SOD活性是通过任意单位（U）占总蛋白质毫克1分钟表 示。 CAT活性评估各100毫升纯化的组织等分试样用于测量吸光度降低，在240纳米（格林 沃尔德，1985）相关的过氧化氢（H2O2）的消耗，并表示为米摩尔 mg总蛋白浓度。进行 GST活性分析定量为50毫升与CDNB每个纯化的样品的反应物在340纳米，以下的Habig等 人（1974）的方法，并表示总的以所得CDNB共轭形成毫克。 2.4 。LPO分析 解剖鳃（正10）和消化腺（正10）匀
17、浆冰。单独用20mM Tris HCl 缓冲液和丁基化羟基甲 苯（BHT）的溶液。100：1毫升比在pH8.6 。以沉淀的细胞质部分，所述匀浆物离心 30000。 g下在4分钟45。等分试样放置一边总蛋白定量根据Bradford的方法（布拉德福 德，1976）。所得细胞质部分通过的量化用于LPO水平的测定的副产物丙二醛（MDA）和 （2E）-4-羟基-2- 壬烯醛（HNE）的形成的吸光度在586纳米以下Redelmeier等人的适应。 （1998）方法。 LPO水平表示为毫摩尔MDA克总蛋白。 2.5 。Ache分析 解剖腮在100mMTRISeHCl缓冲液和 100：1毫升海卫在冰上的 pH
18、值为8.0。在12000离心的速 度，30分钟，温度为4。所得培养上清中分离等份，一个用于总蛋白测定（布拉德福德， 1976），并根据Ellman 等适应其他为 AChE活性分析。 （1961）。 AChE活性是通过测定 增加黄色颜色的所得fromthe生产5-巯基-2-硝基苯甲酸酯在405nm（313.6mm的1-11）由 基板硫代胆碱与DTNB的反应。 AChE活性表示纳摩尔毫克。 2.6 ALP介绍 性别分化的性腺（正10）中匀在25毫摩尔的NaOH缓冲液（含有125 mM氯化钠DTT的 EDTA）中，pH值为7.4。匀浆物离心速度为 12000。30分钟，所得的颗粒被丢弃。每个上 清液
19、的等分试样被保留，以确定总蛋白质含量（布拉德福德，1976）。剩余的胞质级分调 整用35的丙酮和离心在10000的速度，5分钟。所得沉淀溶解，用1M NaOH放置，用于在 604 C加热浴30分钟。磷钼方法（斯坦顿， 1968）被用来计算在660nm 的无机磷酸盐（KH 2 PO 4）的浓度波长。 ALP浓度单位为mgPO4毫克。 2.7 统计分析 所有的生物标志物的结果是平均的。相应的标准偏差是每组的时间，是使用SIGMAPLOT 进行的测试在每个组织和贻贝之间的差异与FLX治疗设定的时间。特设霍尔姆 - Sidak用于 单生物标志物的区别。 Pearson相关用于验证生物标记物之间的依赖性
20、。主成分分析 （PCA）与 XLSTAT进行， 2012年。评估在各组的时间对每个变异生物标志物和FLX食肉 暴露。1）鳃2）消化腺 3）鳃与消化腺。 AChE活性被认为是在鳃，PCA。ALP没有考虑， 因为它是在性腺。统计显着性限定为p 0.05）。相反，以SOD ，CAT活性较高。尽管建立控制和 FLX暴露鳃之间 没有显著的差异，这是明显的CAT活性增加，这是随着时间的推移SOD活性会收到抑制 （P 0.05），在消化腺（图1H），控制保持后，显著下降的第3天，暴露蚌LPO 水平升高，但只有在显著的 2周曝光（4倍高于对照）（P 0.05）。 3.4 Ache活性 乙酰胆碱酯酶（图2）的活
21、性在整个实验中对照个体一致。相反地AChE活性在蚌腮中显著 递增，FLX曝光的第3天之后，接着是渐进的抑制，通过达到对比。对照组一显著的活性较 低（P 0.05）。然而，在暴露的性腺曝光后的3天，ALP水平显著在雌雄中男性更明显。 在此之后，ALP水平被暴露于两种性别中。一周后显著递增，后再次降低到原来水平（P 0.05）。 3.6 鳃和消化腺的主要成分分析 PCA应用于在鳃测量中的所有参数。（图4A）揭示总变化的的72。PC1代表变异的 52，在SOD 活性与其余酶活性与LPO水平的阶乘重量分布反对突出非和FLX暴露鳃之间 的距离。该第二个组成部分（解释只有19的方差）显示CI在当天控制分离
22、进一步的影响， 与上述相反的关系确证 消化腺的PCA （图 4B）表示TEVAR，其中两种组分对总的群体分布（PC1 ，46和 PC2，38 ）类似影响的几乎84。AChE活性没有考虑，因为它是处理仅在鳃。 PC1显示 控件（例外0天），特别是关联的，其余变量SOD活性反对派集群;与7天FLX分离暴露与其 他曝光天消化腺。如观察鳃的PC2，CI，在这种情况下，第 0天对照组的变异性最高的因子， 天15 FLX暴露消化腺由LPO水平进一步影响。消化腺PCA也证实，在CAT和GST活动之间 的直接关系。 PCA（图 5）与具有氧化应激的生物标记物（SOD，CAT，GST和LPO）组织特异性整合，
23、解释的TVar约85（PC1，51 正PC2，34）。第一部分明确分开非和FLX暴露鳃 消化腺治疗组，尤其是关于鳃LPO水平，GST和SOD活性，而消化腺更涉及到CAT的活性。 第二部分重点介绍两种暴露鳃和控制组消化腺的分离，除天0控制和第7天露消化腺和每天 15鳃关于向CAT水平控制，LPO和GST反对SOD。在整个PCA显示的聚集：1）腮与更高的 SOD活性控制 ; 2）FLX 暴露鳃与LPO水平的增加; 3）FLX 暴露消化腺具有较高的CAT活动; 最后4）消化腺反对所有的生物标志物的综合控制。 4 结论 4.1 氧化应激 我们所知，这是关于FLX作为一个潜在的氧化应激诱导采用抗氧化酶贻
24、贝响应活动的效果 的第一项研究。结果显示这两种蚌组织在一个短暂的抗氧化状态的改变。如结合污染物直 接接触，所述显著SOD活性下调呈负状态，在消化腺SOD活性的伴随抑制倾向造成了显著 增强的CAT3两周FLX曝光（后图1和图5）。鳟鱼（虹鳟）肝细胞以FLX已经显示出诱导 ROS产生的增强（拉维尔等人，2004）。其在FLX的存在下抑制被关联到的ROS特别是在 鳃和自消化腺对一般的氧化还原循环和生物转化过程（利文斯通等人，1992）在CAT的催 化作用稍后在该触发组织（Regoli和Principato，1995年）。一个 抑制SOD 的活性也是由乔尔杰维茨等人发现。 （2011）在暴露于5毫克/
25、公斤FLX体重小鼠， 虽然没有观察到增强的CAT活性。此外，较高的CAT活性报道消化腺。同样的贻贝品种暴 露卡马西平（马丁迪亚斯等人，2009年）。总体PCA集群（图5）提供了进一步的验证 SOD的活性水平之间的鳃和消化腺的差异。 GST促进还原型谷胱甘肽（GSH）共轭与亲电子化合物使转型更提取亲水代谢物（Halling - 索伦森等人，1998年）。虽然，GST活性是治疗之间通常短暂两种组织中（图1E和F）。 其他影响变量，而不是暴露自己的动作，这种酶是更敏感的FLX-暴露消化腺显示出比对照 组同时更高的活性（一周后除外），并与CAT活性直接相关。 GST和CAT的增强M.中也观 察之间的正
26、相关关系贻贝暴露消化腺到250纳克L 1布洛芬为在同一时间（冈萨雷斯雷伊和 Bebianno，2012）都为苯扎贝特（Canesi联合。等，2007年），卡马西平（马丁-Diaz等人， 2009）和普萘洛尔曝光（Franzellitti等。，2011）。最后， GST增强证实，通过Canesi 联合 等规定。 氧化酶的改变是无法阻止和反击行为FLX- 曝光，因为是膜损伤明确的组织特异性反应，其 中鳃表现出较高的vulnerably 在FLX- 曝光开始，直到第一个星期结束时LPO 增强在暴露消化 腺（7倍高）持续直到实验（图1G 和H ）的末端。即使暴露腮似乎恢复 2周后，以控制的水 平，PC
27、A （图5 ）表明，FLX 在这一组织中更高的影响比在消化腺随时间。更高水平的LPO 后250纳克L者也观察到1布洛芬暴露在相同的贻贝，特别是在鳃（最大19毫摩尔MDA1 毫克 蛋白质）。 4.2。神经毒性作用 乙酰胆碱酯酶是负责神经递质乙酰胆碱（ACh），以胆碱和乙酸的水解，并在胆碱能神经 功能中起重要作用（Tsuchiya等人，2004），作为神经递质血清素（5-HT ）具有血清素能 神经传递的功能。这些神经递质在许多生理过程例如心脏调控类中起重要作用。桑泽和希 尔，1997年）。其他一些研究表明，它受乙酰胆碱酯酶的诱导，即在放置最终的曝气泻湖 贻贝（加涅等人，2010），没有明显的解释这
28、一事实这超过污染物之间的拮抗作用。AChE 活性的增强意味着乙酰胆碱的枯竭，我们假设几种可能的解释为AChE活性临时增强：神经 递质5-羟色胺浓度的1）上所述的增强。在神经末梢动作已经竞相与乙酰胆碱互相攻击，因 此导致它耗尽，尽管5-HT的贻贝的受体激活机制仍是未知的。由加涅和布莱斯（ 2003）说 明的; 2）乙酰胆碱酯酶增加相关细胞凋亡（ Zhang等人，2002），FLX存在可以促进腮细胞 凋亡。 3）在小鼠大脑皮质细胞雌二醇水平和AChE活性调节之间的关系的报道指出的是， 高水平的17b的雌二醇（E2）的乙酰胆碱酯酶的活性被抑制。 4.3 内分泌干扰 ALP水平由vitellogeni
29、ns （VT）碱性水解后被释放，它是先于蛋黄蛋白卵黄蛋白（Vn的） 的卵生物种（Matozzo等人，2008）。在双壳类，卵黄由雌二醇（E2）和神经肽诱导 （Matozzo等人，2008）。 ALP水平增强是内分泌干扰（ ED），是男性的标志（布莱斯等 人，1999;加涅等人，2002; Matozzo等人，2008）。在FLX曝光的时候，ALP水平普遍较高 （女性最大观察1600毫克PO4毫克）（加涅等，2008）。然而 FLX曝光不诱导在两种性别 分化的性腺的增强的是男性ALP水平，女性是在3天之后。ALP下调是女性性腺激素不足， 通过多环芳香烃的抗雌激素效应（成人贻贝贻贝影响性腺发育也观
30、察多环芳烃）和（蒂斯- Zarragoitia和Cajaraville ，2006 ）。由这些作者指出，它考虑在性腺发育和繁殖双壳类5-HT 的功能，由于这个原因FLX- 暴露性腺，再变更数据是很重要的。此外，ALP下调在暴露的 女性和男性性腺FLX可以被关联到的。E2反比关系与5-HT水平期间中所报告的淡水贻贝和 性腺5-HT的浓度增加 产卵（加涅和Blaise，2003），因为和反对派卵黄蛋白原合成的诱导有关，性腺血清素水平 下降（Matozzo等，2008）。另外，最近拉扎拉等（2012）报道的1.5倍E2的后6天暴露于 200纳克L 1 FLX的贻贝体型的增大。然而，伴随着卵母细胞的减
31、小，酯化E2水平在这种产 卵间减少约38倍从而确认此SSRI是内分泌干扰。 5 结论 在鳃FLX接触蚌两周引起过性抗氧化酶活性的改变。然而，这些变化并没有想象中严重， 整体ALP下调，而突出FLX较高的是内分泌干扰作用，而不是氧化应激诱导。此外，作为 SSRI，对5-HT水平增加导致如前所述，乙酰胆碱酯酶活性明显改变整个实验和胆碱能神经 传递的功能。在组织FLX浓度的测定，以及在这两个非并暴露贻贝的组织，血清素和雌二 醇水平的改变应该清楚地弥补这些发现。最后，FLX存在，即使是在一个相关的环境浓度， 显然有潜力来诱导在贻贝分枝生态理学效应贻贝特别影响其繁殖，所以5-HT受体的激活在 蚌机制还是
32、一个未知数。 致谢玛丽亚冈萨雷斯 - 雷伊博士奖学金（ SFRH/ BD/二千 七分之四万一千六百零六） 从科学技术的葡萄牙外交部葡萄牙科学技术基金会（FCT）。笔者想感谢子项目 EMECORISK的支持：“新兴污染物的影响水生生态系统”的0432-I2TEP-5- E（I2TEP）项 目，FP7- 人-2009-IRSES GENERA项目。德博拉Legibre，玛蒂尔德穆勒和圣卡塔琳娜佩 雷拉在ALP法协议的技术援助。 参考文献 Almeida, J.R., Oliveira, C., Gravato, C., Guilhermino, L., 2010. Linking behaviou
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