1、 放线共生放线杆菌的白细胞毒素 放线共生放线杆菌(简称)是早发性牙周炎(EOP)尤其是 局限性青少年牙周炎(LJP)的重要致病菌。在的各种毒力因 子中1，白细胞毒素(Ltx)得到了广泛关注。不同的株 产生 Ltx 的能力不同。高毒力株 JP2 生成的 Ltx 是低毒力 株 652 的 10-20 倍1，这种显著的差异对的致病力有着 决定性意义2。牙周病变部位的分离株所产生的 Ltx 远 高于健康部位的分离株2。43-75%的牙周病变部位的分 离株可产生 Ltx，即 Ltx+，而 80%以上的健康人分离株则不 具备这种能力，即 Ltx-3。JP2 样高毒力株仅在 LJP 中 可分离到，在健康个体
2、或成人型牙周炎(AP)中只发现 652 样低毒力株4。为进一步了解的致病机理，本文综述了 的 Ltx 的分子特征及作用机理。 1 概 述 Ltx 属于 RTX 毒素家族的一员。RTX 是 G-致病菌产生的 大分子量(100，000-110，000)，Ca2+依赖性细胞穿孔毒素 5，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)的 溶血素，胸 膜肺炎放线杆菌()的溶血素，菊属欧文菌 (Erwiniachrysamthemi)的金属蛋白酶等3。RTX 成员的 基因组成相仿，4 个基因按转录顺序 C，A，B，D 排列构成 操纵子。A 是结构基因，C 编码激活毒素的蛋白，B、D 的基 因产物与毒素的转
3、运定位有关6。 2 Ltx 的蛋白组成和功能 Itx 基因产物 Itx 的操纵也由 C，A，B，D4 个基因组成基因产物分别 发挥特定作用。根据氨基酸序列将 ltxA 的基因产物分为 4 个区域：N 端、中心区、重复区、C 端。 N 端(残基 1-408)：由疏水和亲水基团交替组成。二级 结构中包含 22 个 螺旋，其中有 2 个疏水基团和 5 个与 跨膜和成孔相关的两歧性螺旋。该区的变异导致 ltx 毒性 丧失，提示 N 端与毒素和靶细胞膜的相互作用有关。 中心区(残基 409-729)：包含大量的亲水基团。 重复区(残基 730-900)：由 9 个氨基酸 GGXGXDXUX(X 是 任一
4、氨基酸，U 可为 L，I，U，W，Y 或 F 之一)前后重复而 成。 C 端(残基 901-1055)：该区的缺失造成毒素在胞浆内 潴留，所以 C 端和分泌蛋白相关7。C 端的末 124 个氨 基酸与 RTX 其余成员截然不同，并且 C 端还有 4 个半胱氨 酸，这也是 RTX 中独一无二的。C 端对 RTX 的分泌必不可少， 因而 C 端在结构上的独特之处使的 Ltx 的分泌转运有别于 RTX 的其他毒素7。 上述 4 区中与 Ltx 的种特异性相关部分是残基 688- 941。如将该残基的基因嵌合入溶血性巴斯菌 (Pasteurellhaemolytica)的相应部分，溶血性巴斯菌的白 细
5、胞毒素发生种特异性变异，使只杀伤牛靶细菌细胞的溶 血性巴斯菌的白细胞毒素可杀伤人靶细胞。该区由 14 个前 后重复的 GGXGXDXUX 构成。已明确绿脓假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)这种重复区的三维结构为平行的 片层状构型，其中 GGXGXDXUX 形成连续的右手螺旋 转 折。重复区具有如下特点：1 原核生物中，这种 GGXGXD 序 列属 RTX 和某些酶(如金属蛋白酶)特有：2 包含重复区的蛋 白质通过分泌蛋白如 B、D 的基因产物而不是大多数细胞蛋 白采取的经典信号系统转移至膜，说明重复区与一种新的 分泌过程有关7。除形成 转折外，GGXGXD 还构成一 系列
6、 Ca2+结合点。用同位素标记的 Ca2+检测发现 Ltx 对 Ca2+的亲和力为 10-7M。细菌胞浆内 Ca2+水平低，Ltx 的 Ca2+结合点未被占据，因而处于弹性状态，便于向膜的移 位。一旦分泌至胞外，Ca2+浓度上升，结合位点饱和，Ltx 则形成有细胞毒作用的三维结构 C7，8。相邻两个重复 区末端的 X 之间构成 链，连接前后两个 转折。 ltxA 的基因产物 pI 值在至之间9，10，这种高 pH 值可能与靶细胞特异性和毒素的转运分泌有关。感染位点 pH 值常在以上，所以这种异乎寻常的 pI 可能还与入侵牙周 袋有一定联系10。 ltxC 基因产物 ltxC 与 RTX 其余成
7、员的相应基因至少有 52%的同源性。 RTX 的激活需要 C 基因产物发挥作用。大肠杆菌的溶血素须 经翻译后的修饰才具有生物活性，其中脂肪酸酰化激活过 程需要溶血素 C 基因产物和另一种酰基载体蛋白参与。 ltxC 的产物可能与溶血素 C 作用相似7。 ltxB、D 基因产物 在 B、D 基因产物参与下，ltx 通过非肽依赖的信号系 统转运至细胞表面，与核酸以离子的形式结合7，9。 ltxB-、D-的变异株 ltx 水平可下降 5 倍以上，这种变异株 内 ltxA 和 mRNA 均无改变，之所以下降可能是 ltx 异位的 间接结果2。 3 Ltx 水平的决定因素 的不同分离株合成 Ltx 的能
8、力差别颇大。如将 JP2 生 成 Ltx 的水平定为 100%，则 Y4 产生的 Lx 仅有 10%，33384 只有 2%。影响 Ltx 水平的因素较多，可大致分为基因和环 境两大类： 基因因素 启动子 JP2 和 652 均有 C，A，B，D4 个基因，但启动子不同。 JP2 含有 P1、P2 两个启动子，在 ltxC 的上游还有一个小的 开放阅读框架(ORF)。P1 启动后，ORF、C、A 共同转录一个 的 mRNA。ORF 在体外可翻译一条 10KDa 的蛋白，体内作用 不明。P2 启动后，C、A 转录一个的 mRNA。JP2 的启动子还 能使 C，A，B，D 转录一个 8Kb 的 m
9、RNA，但起点不明。上述 3 种 mRNA 中是优势 mRNA。652 只有一个启动子 P，启动 C，A 转录成的 mRNA，也可启动 C，A，B，D 转录成极少量 的 8KbmRNA。与 JP2 的 ORF 相比，652 的 ORF 多 530bp，因 而 652ORF 不与 ltx 的操纵子共同转录，或者这额外的 530bp 使 ltx 启动子与 C，A，B，D 分离，致 ltx 形成无效 转录。JP2 由于具有两个启动子且 ORF 较小，所以转录效率 远高于 652。ltx 形成两套启动子的机制还不为人所知，推 测 JP2 可能由 652 丢失这 530bp 之后转化而来。Brogan
10、等 对 JP2 和 652 之外的 15 个分离株的启动子分析后发现：启 动子与 652 相似的 13 株 Ltx 水平与 652 相似，与 JP2 相仿 的 2 株 Ltx 水平与 JP2 类似，两种水平的 Ltx 差别也达 10- 20 倍。这一现象显示启动子与 Ltx 水平密切相关11。 转录 不同 Ltx 水平的株 mRNA 水平有差异。Spitzn-agel 按 mRNA 水平对株排序，结果如下： JP2Y4ATCC29253ATCC33384，与它们生成 Ltx 的能力 一致3。这种直接的联系提示 Ltx 可在转录水平得到调 节。推测 C 基因产物可能参与 ltx 转录的调节3。但
11、 mRNA 不能完全解释 Ltx 水平的变化，所以 Ltx 或许还受到 转录后相关蛋白的调节。 环境因素 生长周期 Ltx 的 mRNA 水平在生长周期中发生显著变化。对数生 长期 mRNA 水平上升，进入静止期则明显下降。提示环境刺 激将通过生长周期的影响而改变 Ltx 水平。 培养条件 Kolodrubetz 用 一半乳糖苷酶与 JP2 形成嵌合子 AAM17，发现 Ltx 的产量在厌氧条件下是有氧环境中的 3-4 倍，而与 Fe 离子浓度无关2。Ohta 将 Ltx-ATCC33384 在化学恒定器培养基内培养，发现有活性的 Ltx 生成。 301-6 在厌氧，pH=的果糖培养基内生长，
12、无明显 Ltx 生成。 在牙周袋这种独特的微环境内，pH 值、氧压、营养获得性、 细胞间的相互作用都构成影响毒力因子表达的环境因素 9。 4 Ltx 对靶细胞的作用 的 Ltx 是 RTX 家族中靶细胞特异性极高的毒素，仅作 用于人 PMN，巨噬细胞以及一些高等灵长类的靶细胞。 Rabie 报道的 Ltx 对淋巴细胞有非致死效应13， Simpson 认为这种效应与时间、温度相关14。Mangan 发现的 Ltx 对人淋巴细胞具有时间、浓度依赖的杀伤作用， Ltx=10ng/ml 时即有细胞死亡，100ng/ml，24hr,50%的 T 细胞死亡12。 之所以能产生插膜成孔的破坏作用在于它可稳
13、定地以 两种状态存在：水溶相和插膜相。两相间的转换需要发生 结构改变，有可能通过一个部分展开的球状可溶媒介物。 两相转换必须跨越高能障碍，其意义在于自发状况下不发 生转换，更重要的是特异性的靶细胞与 Ltx 结合之后展开 球状媒介物的部分折叠，降低能量障碍，从而保证了靶细 胞特异性。转换受到多种因素的影响。可溶性球体的弹性 能增加插膜区疏水核心的可达性，使之易与膜接触。插膜 区的层状结构允许螺旋层在膜表面扩展，仅发生局部构造 的改变而不破坏螺旋本身7。 Mangan 研究表明可通过类似细胞坏死和程序性细胞死 亡(PCD)两种方式杀伤 T 细胞。发生坏死或 PCD 与膜损害的 速度和过程有关。快
14、而重的损害则出现坏死，轻而慢则发 生 PCD。10-100ng/mlLtx 可在 T 细胞内造成最大量的 DNA 片段(PCD 的标志)，Ltx100ng/ml，DNA 片段的量不变或 下降，说明低浓度的 Ltx 引发 PCD，高浓度则以坏死为主。 Ltx 造成 DNA 片段的机制不明，Ltx 可能直接作为核酶，或 激活内源性核酶12。Ltx 介导的溶解涉及阳离子选择的 孔道的快速形成，最终使靶细胞渗透性溶解11。RTX 的 另一成员的溶血素在红细胞形成的孔径约 2nm，孔道导体水 平约 350-400ps，具有典型的跨膜通道特性15。RTX 各 毒素作用机制相似，形成的孔道可能具有类似特点。
15、 可使人 PMN、巨噬细胞、T 细胞发生 PCD 或坏死，即能 在牙周病变区损害细胞免疫和体液免疫，这与的致病性关 系密切12。 目前对 Ltx 结构和功能的了解有助于认识牙周病的病 理过程并在牙周病治疗中采取相应措施，如利用不同株 Ltx 水平不同，选择 Ltx-株作适当处理后植入 Ltx+病变位点使 无毒株与有毒株形成生态拮抗，达到抗菌治疗难以得到的 效果。但对 Ltx 仍有许多未明了之处，如 Ltx 发生两相转 换的关键因子是什么，Ltx 以何种方式识别靶细胞，除 C、A、B、D 之外，是否还有别的基因影响 Ltx 的生成、分 泌、定位，ORF 作用何在等等，均有待进一步的探索。 作者单
16、位：华西医大口腔医学院口腔内科 参考文献 1;67(3Supplement):291-297 2;67(3Supplement):309-317 3;59(4):1394-1401 4;67(3Supplement):282-290 5;171(3):916-921 6;174(1):291-297 7;67(3Supplement):298-308 8;269(49):31289-31295 9;61(11):4878-4883 10;58(4):920-929 11;62(2):501-508 12;59(9):3267-3273 13;56(1):122-127 14;56(5):1162 15;264(23):13559-13564
