1、野外水样的 DNA 提取方法 1、用于检测 mcyE 基因表达的芯片与定量 PCR 的研究 Development of a Chip Assay and Quantitative PCR for Detecting Microcystin Synthetase E Gene Expression MATERIALS AND METHODS： 从无菌的产肝毒素 Anabaena sp.90 and Microcystis aeruginosa PCC 7806 提取 DNA 和 RNA。藻种在 Z8 培养基中培养 21 天，25C ， 5-6mol m-2s-1 不连续光照，采用 5m 孔 径
2、的聚碳树脂滤器收集细胞。此外，为使 qPCR 最优化，从 15 株 Microcystis,13 株 Anabaena, 2 株 Planktothrix,2 株 Nostoc, 及 2 株 Nodularia 提取 DNA 备用。 2006 年 6 月至 9 月从 Tuusulanja rvi 湖采集 5 个水样。用带槽样板从 0-2 米深处采集 100-250ml 复合水样，并用 5m 及 1m 孔径的聚碳树脂过滤收集。 对样品的 DNA、 RNA 及微囊藻毒素进行收集。用于 RNA 提取的水样在湖滨取样后立即过滤，原位 冻存在液氮中。而用于 DNA 及微囊藻毒素提取的水样运输到实验室后再
3、过滤。在提取前， 用于 DNA 和微囊藻毒素提取的样品冻存在-20C，用于 RNA 提取的样品冻存在-70C。 核酸提取及反转录： 采用 bead beating and the cetyltri methylammonium bromide (CTAB) 法提取藻种及野外水 样中的 DNA（Kolmonen18） 。根据 Gene Clean Turbo kit 指南进行进一步纯化(Q-Biogene) 。 通过紫外分光光度计(Biophotometer;Eppendorf)测量提取的 DNA 含量及质量。 RNA 提取时，过滤器转换到 FastPrep Lysing matrix Etub
4、es (Q-Biogene)，细胞裂解于 1 ml PMR1 溶液(MO BIO Laboratories Inc.)中，用 FastPrep FP120 bead beater(Thermo Electron Corporation)于 5m s-1，搅拌 40s。随后，用 Ultraclean Plant RNA kit Mo Bio Laboratories)分 离 RNA。对于环境中的 RNA 样品，将两个过滤器联合使用以增加总的 RNA 量。提取的 RNA 用 DNase I 按说明书（Promega）处理两遍。处理后的 RNA 用苯酚- 氯仿萃取，以使 酶失活及去除，乙醇沉淀，用水
5、稀释至终体积为 50l。采用 NanoDrop-1000 分光光度计 测(Nanodrop Technologies)量 RNA 的含量及质量。通过 mcy E qPCR 证实 RNA 样品中不含 DNA。用 5 至 15l 的 RNA 作为模版，iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)为试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA。 参考文献：Kolmonen, E., K. Sivonen, J. Rapala, and K. Haukka. 2004. Diversity of cyanobacteria and heterotrophic bacteria in
6、 cyanobacterial blooms in Lake Joutikas, Finland. Aquat. Microb. Ecol. 36:201211. 备注：该文章对水样进行显微镜观察，以便将结果与芯片检测结果 作对照 2、 Diversity of cyanobacteria and heterotrophic bacteria in cyanobacterial blooms in LakeJoutikas, Finland. Aquat. Microb MATERIALS AND METHODS： 2002 年及 2004 年从几个不同的湖泊采集水样。采用铺平板法分离单细胞蓝
7、藻，重复该 步骤 3 次或 3 次以上。 （Shirai，1989） 采用两步分离法（Shirai,1991）分离无菌藻种。简要地说，就是通过将含藻细胞的液体 以 1：100 稀释后，用漩涡混合器摇动生长中期的培养基，使群落分散开，用 1.5ml 的离心 管取 1ml 该培养液于 400g，20离心 20min。接着，8，000g 离心 10min，用微量吸 液管将处于表层的悬浮细胞（1l）吸取后平铺到 CB 琼脂培养基中（0.4% 的琼脂糖 LO3，Takara Bio,Otsu,Japan）.M.aeruginosa K-139,其 mcy 基因结构已经鉴定，被用作 mcy 阳性克隆。藻类
8、培养条件：30，35mol m -2s-1 白炽灯连续光照。 DNA 提取及操作： 蓝藻细胞水浴超声 10s（36KHz，200W）使气囊裂解，随后 8000g，3min 离心收集。 参照（Nishizawa，1999）方法，当细胞处指数生长期末期时提取蓝藻宏基因组 DNA。用 大肠杆菌 DH5MCR 及 JM109 作为质粒重组载体，将其于 37，2YT 琼脂培养基培养。 下面工作所需的抗生素为：氨苄 75gml -1 卡那霉素 15 gml-1。克隆用的连接载体为 Pgem-Teasy vector。DNA 提取过程见（Sambrook，1989） 。 参考文献：Shirai，1989De
9、velopment of a solid medium for growth and isolation of axenic Microcystis strains(Cyanobacteria）.AppL.Environ.Microbiol.,55,2569-2571. 3、 微囊藻的分离纯化培养及产毒特性鉴定 初步分离预培养 将采集藻样稀释至适当浓度 ,在显微镜下用毛细管挑取微囊藻细胞单藻落 ,放入装有 10ml 培养基的消毒过的小三角瓶中 ,进行预培养 12 周 ,得到微囊藻的预培养液。 分离纯化 取 5ml 预培养液于 10ml 离心管 ,3000rP min 离心 15min ,弃上清
10、 ,加入 1ml 灭菌培养 基 ,重悬移入 115ml EP 管 ,3000rP min 离心 15min ,弃上清 ,加入 1ml 灭菌培养基 ,剧烈振 荡重悬 ,如此重复 5 次。然后 ,用移液器反复吹打 ,尽量使藻细胞群体破裂为单细胞。在显 微镜下用细胞计数板计数(浓度大时需稀释后重新计数 ) ,根据所计藻细胞密度 ,将培养液稀 释至每 300 l 含 018 个藻细胞单位。充分混匀后 ,用移液枪依次吸取 300 l 稀释培养液 于 96 孔培养板的每个孔中 ,加盖用封口膜将培养板密封 ,防止液体挥发。将 96 孔细胞培 养板置于光照培养箱中培养 , 612h 后在倒置显微镜下仔细观察并
11、标记单细胞孔。待标记 的单细胞孔内细胞增至 500 个以上或出现颜色时 ,可进行转接扩大培养。 4、 Diversity of cyanobacteria and heterotrophic bacteria in cyanobacterial blooms in Lake Joutikas, Finland MATERIALS AND METHODS： 2001 年 8 月 22 日及 23 日从 Joutikas 湖采集水样。Joutikas 湖是芬兰南部一个富营养化湖 泊。它既小又浅，其蓝藻水华泛滥已持续多个夏天。实验 a tube sampler 从 0-0.3 米采集水 样用于核酸提
12、取。用 5m 孔径的聚碳树脂（ 47mm）收集蓝藻，1m 及 0.2m 的聚碳树 脂收集剩余的细菌。采样 30Min 内过滤水样。从水体表层（大约 1cm）处分离水华样品。 过滤器和水华样品置于 2ml 的聚丙烯管子（Nalgene）中，立即冻存于液氮中。到实验室后， 用于 RNA 提取的样品冻存在-80，用于 DNA 提取的样品栋存在-20。除此之外，进行 毒素分析。通过显微镜计算蓝藻细胞个数并用研究所的数据库转化为生物量。通过环境研 究中心研究水样的物理及化学性质。 Nucleic acid extraction 通过 bead beating 及 CTAB（十六烷基- 氨盐-溴化物）法结
13、合 FastPrep tubes 及 FastPrepFP120 bead beating system（Bio101 ）提取 RNA 和 DNA。冷冻的过滤器被转移到 FastPrep tubes 中（溶解矩阵 A 是用来提取 DNA 的，溶解矩阵 C 是用来提 RNA 的）包含 1ml 的冰细胞溶解缓冲液（100mMTris-HCL,PH8,1.5%SDS,10mMEDTA,1%deoxycholate 脱 氧胆酸盐，1%Igepal-CA630, 5 mM thiourea, 10 mM dithiothreitol） 。通过 FastPrepFP120 bead beater 5.0
14、m s1， 30s 使细胞裂解。管子均化后置于冰上 5min，后 15 300 g 离心 1min.2ml 的管子中上清液（1ml）一分为二。225 l of 5 M NaCl and 170 l of 10% CTAB in 0.7 M NaCl were added and mixed. 管子在 65孵育 20min。加入等体积的氯仿，混合后 10600g 离心 10min。2002 年的来自 5m 的过滤器的 DNA 及 RNA 样品要用 10%的 CATB 处理 2-3 次，以减少多聚糖的含量。上层大约 450l 收集于 1.5ml 的离心管中。用 96%的冰乙醇沉淀并溶于 50 l
15、的水中。 DNA 提取物用 PrepA-Gene purification kit (Bio-Rad)或者 NuckeoTrap purification kit(Macherey-Nagel)(2002 年) 纯化。部分 RNA 样品用无 Rnase 的 Dnase（Promega）37下 处理 30min。用用苯酚-氯仿萃取物使 Dnase 失活，并去除 Dnase，随后用乙醇沉淀。用 1.5%的 琼脂糖凝胶检测 DNA 的质量，用 1.2%的琼脂糖甲醛凝胶检测 RNA 的质量。 5、 采用套式 PCR 检测水库产毒微囊藻 水库水样藻细胞的收集 水样为表层水,采集后分成 2 份 ,于冰壶中
16、低温保存带回实验室 ,- 20 冷藏备用。采 样时间从 2003 年 3 月至 2004 年 12 月。将水样解冻后 ,充分混匀; 取 2mL 水样于离心 管中 ,13 000r/ min 离心 10min ,弃上清。用 30 L 无菌双蒸水重悬沉淀。 阳性藻株和阴性藻株藻细胞的收集 各选取处于对数生长期的五株产毒微囊藻(均经 HP LC 和 E LISA 进行毒素测定验证) 和 5 株不产毒微囊藻(由暨南大学水生生物研究中心分离保存) 作为实验材料藻密度经镜检 计数约为 107 108cells/ mL。取原藻液 011mL ,加双蒸水至 1mL ,振荡混匀后 13 000r/ min 离心
17、 10min ,弃上清;沉淀用 1mL 无菌双蒸水悬浮,重复洗涤两次。沉淀的藻细胞用 100 L 无菌双蒸水重悬。 总结：水中蓝藻 DNA 的提取方案 1、 采样及过滤 用带槽样板从 0-2 米深处采集 100-250ml 混合水样，用 5m 孔径的聚碳树脂 （47mm）收集蓝藻（采样 30Min 内过滤水样） 。从水体表层（大约 1cm）处分离水华样品。 过滤器和水华样品置于 2ml 的聚丙烯管子（Nalgene）中，立即冻存于液氮中。到实验室后， 用于 RNA 提取的样品冻存在 -80，用于 DNA 提取的样品栋存在-20。 2、DNA 提取 通过 bead beating 及 CTAB（
18、十六烷基- 氨盐-溴化物）法结合 FastPrep tubes 及 FastPrepFP120 bead beating system（Bio101 ）提取 DNA。 冷冻的过滤器被转移到 FastPrep tubes 中（溶解矩阵 A 是用来提取 DNA 的）包含 1ml 的冰细胞溶解缓冲液（100mMTris-HCL,PH8,1.5%SDS,10mMEDTA,1%deoxycholate 脱氧胆 酸盐，1%Igepal-CA630, 5 mM thiourea, 10 mM dithiothreitol） 。通过 FastPrepFP120 bead beater 5.0 m s1， 30
19、s 使细胞裂解。管子均化后置于冰上 5min，后 15 300 g 离心 1min。2ml 的管子中上清液（1ml）一分为二。225 l of 5 M NaCl and 170 l of 10% CTAB in 0.7 M NaCl were added and mixed. 管子在 65孵育 20min。加入等体积的氯仿，混合后 10600g 离心 10min。2002 年的来自 5m 的过滤器的 DNA 样品要用 10%的 CATB 处理 2-3 次，以减少多聚糖的含量。上层大约 450l 收集于 1.5ml 的离心管中。用 96%的冰乙 醇沉淀并溶于 50l 的水中。 DNA 提取物用
20、PrepA-Gene purification kit (Bio-Rad)或者 NuckeoTrap purification kit(Macherey-Nagel)(2002 年) 纯化。用用苯酚-氯仿萃取物使 Dnase 失活，并去除 Dnase，随 后用乙醇沉淀。用 1.5%的琼脂糖凝胶检测 DNA 的质量。采 集 表 层 水 样 1L左 右用 冰 盒 冷 藏 后 带回 实 验 室经 单 层 纱 布 过 滤无 菌 水 反 复冲 洗 2-3次滤 液 5 m孔 径 滤 膜 滤 液 0.45 孔 径滤 膜含 蓝 藻 细 胞 的 滤 纸细 胞 室 专 用 刮 刀含 无 菌 水 的 小 型 培 养 皿DNA提 取
