1、【一、提 RNA】 一、实验准备： 1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口 EP 管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA 专用)、 2、配 75%乙醇(DEPC 水+无水乙醇)，放-20冰箱预冷； 3、预冷离心机(1.5mL EP 管用的)； 4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩； 二、操作步骤： 01、弃上清（不回收，直接倒去）； 02、1mL/孔 PBS 洗两遍（不回收，直接倒去，随后用 200L 枪吸尽 PBS）； 03、每孔加 500L Trizol，轻晃，随后室温放置 2min 左右； 04、枪头吹打，吸出放入 1.5mL 进口 EP 管； 05、加入 100L
2、 氯仿(即 1/5 体积的 trizol)； 06、4离心机，12000g，15min； 07、吸 200L(可减少)上清放入新的 1.5mL 进口 EP 管中（注意：只能吸到上清）； 08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置 10-30min(15min)； 09、4离心机，12000g，10min； 10、倒掉液体，加入 1mL 预冷的 75%乙醇剧烈混匀； 11、4离心机，7500g，5min； 12、倒掉上清，加入 1mL 预冷的 75%乙醇，混匀； 13、4离心机，7500g，5min； 14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者 200 微升枪头去掉管壁上的水珠；
3、 15、每管中加入 40L(40-60L)的 DEPC 水，吹打溶解； 16、测浓度（先知楼 21 楼测 RNA 浓度，带 DEPC 水、灭菌的 dd 水、10 微升枪和枪头）； 三、注意事项 01、如果当时不测 RNA 浓度，可暂时把 RNA 放在-20冰箱。但长时间(24h)保存，需要放 在-80冰箱； 02、异丙醇作用是沉淀 RNA，作用比乙醇好； 03、 04、 05、 06、 07、 08、 09、 【二、测 RNA 浓度】 一、实验准备： 01、先知楼 21 楼-2109 教室，一个冰盒+DEPC 水+10 微升枪、灭菌 dd H2O、10L 枪头 (RNA 专用)、本子+笔； 二
4、、操作步骤： 01、登记； 02、打开电脑=打开“N”软件=点击“Nucleic acid”=选择“OK”=选择“RNA”； 03、灭菌 dd H2O 清洗 2-3 遍，擦干； 04、DEPC 水 校零：即加 DEPC 水一滴，点击“Blank”，擦干； 05、测 RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品； 06、记录数据，包括 RNA 浓度（0.1。（请注意，这个值跟仪 器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯 物的干扰通常会对光有一定吸收，其值加 3 号试剂 (0.5L)=加 4 号试剂(0.5L)=加 2 号试剂(0
5、.5L)=加 RNA=离心=上机； 02、上机：OPEN=点击“User”菜单下的“clx”，点击“Accept”=选择“run”下面 的到“exp001 rt”=修改体系“10L”(默认为 25 微升)=点击“Start”，进入界面； 03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min； 04、4冰箱保存； 三、注意事项 01、加液尽量无气泡，枪不要打到底； 02、严格冰上操作，防止 RNA 降解； 【qRT-PCR】 一、实验准备： 01、试剂：Roche 的 SyBr Green(rox) 02、1.5mL EP 管、0.2mL EP 管、96 孔板/八连冠； 10L、20L
6、、100L、200L、2.5L、1000L 枪； 03、冰盒一个、Rox 化冻(避光)、引物化冻（GAPDH）、cDNA、DEPC 水； 二、操作步骤： 01、 Rox 10L； + dd H2O 6L； + P1(F) 1 + P2(R) 1 + cDNA 2 -20L 体系 02、计算：每个样，X 个抗体(至少包括 GAPDH-内参,还有目的)，三个副孔。 即如果六个样，2 个抗体(GAPDH,PLK1)，三个副孔。6*1*3=1820(PLK1)， 6*1*3=1820(GAPDH)； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 6/PLK1 6/PLK1 6/PLK1 5/P
7、LK1 5/PLK1 5/PLK1 6/GAP 6/GAP 6/GAP 5/GAP 5/GAP 5/GAP 4/PLK1 4/PLK1 4/PLK1 3/PLK1 3/PLK1 3/PLK1 2/PLK1 2/PLK1 2/PLK1 1/PLK1 1/PLK1 1/PLK1 4/GAP 4/GAP 4/GAP 3/GAP 3/GAP 3/GAP 2/GAP 2/GAP 2/GAP 1/GAP 1/GAP 1/GAP PLK1 Rox：10*20=200L DEPC 水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L GAPDH Rox：10*20=200L DEPC 水：6*2
8、0=120L F：1*20=20L R：1*20=20L 03、稀释 cDNA 10 倍(18L DEPC 水+2L)=配置 Mix(Rox+ DEPC 水+F+R)=加样(一横 排先加 18L mix(GAPDH)，随后加入 18L mix(PLK1)。 随后六个孔加同一个 cDNA； 06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后2000rpm 离心，时间 不定(5s 即可)； 07、上机+设置程序： A、双击打开程序“ StepOne Software v2.1 ”=点击“ OK ”=点击“Ignore 1.5;3;6;9;12) ，则点击“Add New Sample
9、”，出现 “Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六 个=将其重命名； Plate Setup 界面-Assign Targets and Samples 界面： GAP/1 GAP/1 GAP/1 GAP/2 GAP/2 GAP/2 GAP/3 GAP/3 GAP/3 GAP/4 GAP/4 GAP/4 Plk1/1 Plk1/1 Plk1/1 Plk1/2 Plk1/2 Plk1/2 Plk1/3 Plk1/3 Plk1/3 Plk1/4 Plk1/4 Plk1/4 Akt/1 Akt/1 Akt/1 Akt/2 Akt
10、/2 Akt/2 Akt/3 Akt/3 Akt/3 Akt/4 Akt/4 Akt/4 PI3K/1 PI3K/1 PI3K/1 PI3K/2 PI3K/2 PI3K/2 PI3K/3 PI3K/3 PI3K/3 PI3K/4 PI3K/4 PI3K/4 GAP/5 GAP/5 GAP/5 GAP/6 GAP/6 GAP/6 Plk1/5 Plk1/5 Plk1/5 Plk1/6 Plk1/6 Plk1/6 Akt/5 Akt/5 Akt/5 Akt/6 Akt/6 Akt/6 PI3K/5 PI3K/5 PI3K/5 PI3K/6 PI3K/6 PI3K/6 D、Run Method 界面：设置温度；随后修改“Reaction Volume Per Well”，将其改为 “20L 体系”； E、点击“Start Run” 三、注意事项 01、注意一定要禁止气泡。 吸液体时，观察枪头中有没有气泡和液体；打加入液体时，延管壁加入，枪头只能打 到第一档，随后观察枪头有没有打尽； 02、加入引物时，一定要涡旋混匀； 03、Rox 加入后，一定要避光； 04、加入的液体一定要等量；
