1、酶工程,酶,定义：一种生物催化剂，具有作用专一性强、催化效率高等特点，能在常温常压和低浓度条件下进行复杂的生化反应。包括核酶及蛋白质酶。,酶工程,酶 工 程,酶工程,定义 利用酶的特异催化功能，将一种物质转化为另一种物质的技术.,优良产酶菌种的筛选,基本步骤采样 菌种分离 产酶性能测定 复筛,酶工程,基因工程菌的构建,酶工程,定义 在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶。包括培养基的选择发酵方式的选择发酵条件的控制管理,酶工程,微生物酶的发酵生产,碳源 淀粉、糖蜜、蔗糖等。 氮源 有机氮（豆饼粉、花生饼粉）、无 机氮无机盐类 低浓度有利于酶产量的提高， 有些金属离子是酶的组分
2、。 生长因子 细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱。pH值 应根据微生物的需要调节pH值。,培养基,酶工程,固体发酵 用于真菌的酶生产。方法简单，但操作条件不易控制。液体深层发酵 关键是对温度、通气、搅拌和pH的控制。产品回收和提纯工艺简便。,酶的发酵生产方式,酶工程,添加诱导物 分为酶的作用底物；酶的反应产物；酶底物类似物。降低阻遏物浓度 措施：分次添加碳源、产物类似物可解除反馈阻遏。表面活性剂 肥离子型表面活性剂常被用作产酶促进剂。,提高酶产量的措施,酶工程,工业用酶 一般无需高度纯化，如洗涤用蛋白酶。食品工业用酶 需适当的分离纯化，以确保安全卫生。医药用酶 需经过高
3、度纯化，不能含有热源物质。,酶工程,酶的分离纯化,基本原则 提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌；要求在低温下操作；低盐浓度；操作中加入缓冲溶液；防止微生物的污染。,酶工程,酶的分离纯化,酶工程,酶制剂的制备,破碎细胞 对胞内酶的提取。有机械破碎法、酶法、化学试剂法、物理破碎法。溶剂抽提 稀酸、稀碱、稀盐溶液。分离 离心机、板框压滤机。浓缩 吸附、沉淀、凝胶过滤、真空薄膜浓缩。干燥 固体酶比液体酶保存时间长。常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥。,酶工程,酶的纯化与精制,离心分离 凝胶过滤透析与超滤,根据分子大小和形状,根据酶分子电荷性质,离子交换层析 层析聚焦电泳
4、等电聚焦,凝胶过滤,指混合物随流动相经过固定相(凝胶)的色谱柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。又称分子筛色谱。,酶工程,组成上的特点,固定相（凝胶） 是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质。又因整个色谱过程一般不变换洗脱液，好象过滤一样，故称凝胶过滤。,凝胶过滤,凝胶过滤分离示意图,（1）样品溶液加在色谱 柱顶端；,（2）样品溶液流经色谱 柱，小分子通过扩 散作用进入凝胶颗 粒的微孔中，而大 分子则被排阻于颗 粒之外。大、小分 子因向下移动的速 度发生
5、差异而被分 离开来；,（3）向色谱柱顶加入洗 脱液，大、小分子 分开的距离增大；,（4）大分子已经流出色 谱柱,凝胶过滤,透析,其特点是半透膜两边都是液相，一边是试验液，另一边是纯净溶剂（水或缓冲液）。试验液中不可透析的大分子被截留于膜内，可透析的小分子经扩散作用不断透出膜外，直到两边浓度达到平衡。,透析法多用于制备及提纯生物大分子时除去或更换小分子物质、脱盐和改变溶剂成分。,酶的分离方法,透析袋简单装置,酶的分离方法,超滤,加正压在膜两边产生压差的方法 产生负压,原理 加压膜技术之一，与一般过滤一样，主要依赖于被分离物质分子量的大小、形状和性质不同，在一定的压力差（外源N2或真空泵压）下，使
6、小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，限额以上的大分子被膜阻留，使不同大小的分子得以分离。,酶的分离方法,超滤示意图,超滤,离子交换层析法,原理 离子交换树脂是一种具有离子交换能力的高分子化合物，不溶于水、酸、碱及普通有机溶剂，化学性质稳定。由两部分组成：树脂的骨架(R)，是多价高分子基团，具不溶于水的网状结构；交换基（可扩散离子），具有可交换的离子活性基团，这两部分带有相反电荷。,组成 固定相:离子交换树脂 流动相:需要分离的溶液,酶的分离方法,阳离子树脂,R+OH- + M+A- R+A- + M+OH-,可扩散离子是阳离子,离子交换法,阴离子树脂 可扩散离子是阴离子,交换过程,离子交换层
7、析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和等过程，是综合作用的结果。,离子交换法,酶工程,酶活力,酶活力 酶催化一定化学反应的能力。通常用国际单位表示：以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1mol产物所需要的酶量为一个酶活力单位U（Unit）。 一个“Katal”单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。 Kat和U的换算关系：1 Kat=6107U,酶工程,酶的比活力,比活力（specific activity） 每单位（mg或mL）蛋白质中的酶活力单位数，如：U(或Kat)/mg（或mL）蛋白。对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是
8、评价酶纯度高低的一个指标。,酶工程,酶制剂的保存,温度 酶的保存温度一般在0-4。,缓冲液 大多数酶在特定的pH范围内稳定，偏离这个范围便会失活，因酶不同而异。,氧化/还原 由于巯基易被氧化，这类酶应加还原剂或在氩气或氮气中保存。,蛋白质的浓度及纯度 酶浓度越高越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存。,酶分子修饰 通过酶蛋白主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。,酶分子的改造,酶工程,金属离子置换修饰 大分子结合修饰 肽链有限水解修饰 侧链修饰,酶的化学修饰技术,酶工程,微生物的基因经修饰后能
9、产生所需的酶,酶工程,酶分子的修饰,酶分子的修饰,酶工程,酶的蛋白质工程,酶的蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，仍需要应用基因工程的全套技术。但酶的基因工程主要解决酶大量生产的问题，而蛋白质工程则致力于天然蛋白质的改造，制造各种定做的蛋白质。,酶的蛋白质工程,目前酶蛋白质工程主要集中在工业用酶的改造。例如，用作洗衣粉添加酶的枯草杆菌蛋白酶，能分解衣服上的血迹和汗渍，但已被漂白剂氧化失活。改造方法：,Ser或Ala 替代蛋白酶的222位Met 0.5mol/L H2O2中1h仍不失活 与漂白剂混合使用,酶的蛋白质工程,杂交酶,利用基因工程将来自两种或两种 以上酶的不同结构片段构建成的新酶
10、。新构建的杂交酶的特性，通常介于其双亲酶的特性之间。,酶的蛋白质工程,模拟酶,在深入了解酶的结构与功能以及催化作用机制的基础上，近10年来，有许多科学家模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成了人工酶催化剂。,酶的蛋白质工程,人工模拟酶,半合成酶：例如将电子传递催化剂Ru(NH)33+与巨头鲸肌红蛋白结合，产生了一种“半合成的无机生物酶”，把能和氧气结合而无催化活性的肌红蛋白变成能氧化各种有机物（如抗坏血酸）的半合成酶，它接近于天然的抗坏血酸氧化酶的催化效率。全合成酶：是一些非蛋白质有机物，通过并入酶的催化基团与控制空间构象，从而像天然酶那样专一性地催化化学反应。例如，利用环糊精
11、成功地模拟了胰凝乳蛋白酶、转氨酶等。其中胰凝乳蛋白模拟酶催化简单酯反应的速率和天然酶接近，但热稳定性与pH稳定性大大优于天然酶，模拟酶的活力在80仍能保持，在pH213的大范围内都是稳定的。,酶工程,酶的固定化,固定化酶（immobilized enzyme） 将水溶性的酶固定于固相载体上,形成具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离。优点：仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可反复使用，具有较高的经济效益。,酶的固定化,酶的固定化方法,酶的固定化,酶的固定化,酶的固定化,细胞的固定化,酶反应器,酶工程,酶反应器,酶反
12、应器,酶反应器,填充床型反应器,酶反应器,膜式酶反应器,酶反应器,生物传感器,酶工程,是一类用生物活性物质作敏感器件，配以适当的换能器，将生物体内的化学信号转化为电、热、光等讯号的传感检测器。,转换器,电信号,被检测物质,固定化酶膜,生物传感器,第一代：由固定化酶膜和电化学器件组成 的酶电极； 第二代：微生物、细胞器、动植物组织、 免疫等生物传感器；第三代：生物电子学传感器，将具有智能。,酶工程,关键元件：生物敏感膜（分子识别元件）,生物传感器分类,酶传感器：酶膜作为识别元件。 组织传感器：利用动植物组织中多酶系统的催化 作用来识别分子。微生物传感器：将微生物固定在膜上的生物传感 器，利用其呼
13、吸作用或所含的酶。免疫传感器：利用抗体与抗原之间的高特异性， 将抗体固定在电极表面制成工作电 极。场效应晶体管生物传感器：将生物技术与晶体管 工艺结合的第三代生 物传感器。,酶工程,生物传感器的发展前景,功能多样化：未来的生物传感器将进一步涉及医疗保健、疾病诊断、食品检测、环境监测、发酵工业的各个领域。目前, 重要是研究能代替生物视觉、听觉和触觉等感觉器官的生物传感器,即仿生传感器。 微型化：随着微加工技术和纳米技术的进步，生物传感器将不断地微型化，各种便携式生物传感器的出现使人们在家中进行疾病诊断，在市场上直接检测食品成为可能。,酶工程,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,生物传感器的前景
14、,智能化与集成化：未来的生物传感器必定与计算机紧密结合，自动采集数据、处理数据，更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一条龙,形成检测的自动化系统。同时, 芯片技术将越来越多地进入传感器领域,实现检测系统的集成化、一体化。低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命：生物传感器技术的不断进步，必然要求不断降低产品成本，提高灵敏度、稳定性和延长寿命。这些特性的改善也会加速生物传感器市场化、商品化的进程。,发酵罐,主机,计算机,SBA-60型生物传感在线分析系统，为发酵自动控制提供了新的基础平台,实验室制造的生物传感分析仪,酶的应用（1）,食品工业的多面手 利用淀粉作原料，通过-淀粉酶、糖化酶、固定
15、化葡萄糖异构酶的催化作用，生产出甜度比蔗糖高得多的高果糖桨。为医药工业闯新路 利用一种专一性的酶，切下并移去猪胰岛素链上的最后两个丙氨酸，然后再边接上一个苏氨酸，这样猪的胰岛素就变成了人的胰岛素，在治疗人的糖尿病时就不会再产生免疫反应了。,酶工程,酶的应用（2）,洗衣刷碗的好帮手 日常洗涤用品中通常含有聚磷酸钠、表面活性剂和氧化剂等成分。而在其中添加蛋白酶等酶制剂，开发出多功能、低污染、高效节能的洗涤用品。化学工业的新伙伴 利用丙烯腈作原料生产用途广泛的丙烯酰胺。饮料工业锦上添花 将蛋白酶、淀粉酶等作为添加剂补充给幼畜；在植物源饮料中添加水解草酸的酶，消除抗营养因子；添加纤维素酶，提高饮料利用
16、率等。,酶工程,酶的应用（3）,纺织工业又绽奇葩 利用蛋白酶去除丝毛织物中的丝胶蛋白；利用纤维素酶处理牛仔服和改良苎麻织物的性能等。造纸工业的希望 在制桨阶段帮助漂白的木聚糖酶以及分解松木纸桨中松脂的脂肪酶和脱除废纸油墨的纤维素酶。得力的环境卫士 利用磷酸脂酶原地降解有机磷神经毒剂和杀虫剂。,酶工程,酶的应用（4）,基因工程必备工具 基因工程需要的限制性内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶等。神奇的检测和传感 用酶法分析代替传统的物理化学分析方法，精确地测定出血尿等液体中某一物质的含量。,酶工程,结 束,返回总目录,作 业,一、术语解释凝胶过滤、酶活力、比活力、酶分子修饰、杂交酶、酶固定化、酶反应器、生物传感器二、问答题1.简述离子交换层析法的原理及过程。2.p152：1、3题,
