1、结核病实验室涂片镜检技术,王 甦 民北京结核病控制研究所2010年12月,结核病基本情况： （1）,结核病是一个古老的疾病，至今仍然严重威胁着人类健康。近十几年来，由于结核菌的耐药性、 HIV/TB双重感染 移民（流动人口）问题 使全球结核病控制工作面临严重挑战。,全球结核病告急,据世界卫生组织估计目前全球约有：1/3人口（20亿）感染结核菌；2000万结核病人；每年有800万-1000万新发病例；每年300万人死于结核病；,我国结核病现状,我国的结核病疫情依然十分严重，是世界上结核病患病率最高的22个国家之一。是耐药结核病最多的全球27个国家之一。每年新登记的结核病患者约130万。,我国结核
2、病现状,2000年全国结核病流行病学抽样调 查初步结果显示：全国受结核菌感染人口超过5.6亿；全国现有传染性肺结核病人200万，传染性肺结核患病率为157.8/10万。结核病死亡率为9.8/10万，在各种死亡原因中占第11位。结核菌耐药率：27.8%，初始耐药率18.6%，获得性耐药率：46.5%。INH:17.6%，SM：17.3%，RFP：16.6%，EMB：1.5%，MDR：10.7%。非结核分枝杆菌感染：11%,我国结核病现状 我国历次流调疫情,结核病细菌学检查的重要作用,是结核病临床诊断和治疗的重要依据是直接发现病原菌的诊断方法，比影象学、免疫学等检查具有更高的特异性是确定、调整化疗
3、方案的重要依据是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分是发现传染源的最主要途径和手段是考核疗效、评价防治效果的可靠指标,分 枝 杆 菌生 物 学 基 础,概 述,结核分枝杆菌是1882年郭霍（Robert Koch）从肺结核病人痰标本中发现。是人类结核病的主要病原菌。,分类,结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。,概 述,分枝杆菌呈分支状生长， 营养要求比普通细菌高，是一种生长缓慢的革兰氏阳性杆菌。经石炭酸复红染液着色后，不被盐酸酒精脱色，故称此类细菌为抗酸菌。,分枝
4、杆菌分类,结核分枝杆菌结构,结核分枝杆菌组成：细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质,细 胞 壁,厚度为1035nm，较一般细菌的细胞壁厚。含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。功能：保护细菌的固有形态抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和 杀伤如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下生存，则称此类细菌为L型细菌。,细 胞 膜,细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的半透膜。主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。功能：细菌与外界环境进行物质交换在细胞内一系列代谢活动中起重要作用,菌 体 成 分,脂类多糖蛋白质核酸盐类,脂 类（1）,结核菌体脂类含量比其他细菌高，占细胞壁干重的60，是引起结核病特征性变化与表现的物质基础
5、。脂质含量与细菌毒力相关，毒力强的Mtb含脂最高。脂质只要有磷脂、脂肪酸、蜡质等成分，多与蛋白质、多糖以结合形式存在。,脂 类（2）,磷脂：刺激机体单核细胞增生，增强菌体成分诱导机体致敏作用。索状因子：与Mtb毒力密切相关。硫脂蜡质：占脂质总量48，分A、B、C、D。结核菌酸：促进机体形成结核结节。分支菌酸：为结核菌菌体的重要成分，与结核菌的抗酸性有关。,多 糖,由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等组成。多以脂类、蛋白质和核酸等结合形式存在。是免疫反应的重要抗原物质。,蛋 白 质,Mtb含多种蛋白质组分，由不同菌体蛋白及活菌在分泌过程中分泌于细胞外的多种蛋白组成。结核菌的主要抗
6、原性物质。结核菌素、PPD为多种蛋白的复合抗原，可刺激机体免疫应答。,核 酸,RNA含量比DNA高45倍。RNA分布于细胞质内，DNA存在于细胞核物质中。DNA是遗传物质，将遗传信息传给子代，并指导RNA的合成。RNA是蛋白质和其他细胞成分合成必须的物质。,结核分枝杆菌基因组,结核分枝杆菌DNA中约含4000个基因组。结核分枝杆菌为2.5109道尔顿, 卡介苗株为2.8109道尔顿结核分枝杆菌H37Rv基因组全序列共含4.4106碱基对，平均鸟嘌呤+胞嘧啶含量（GC）为65.6。,盐 类,钙、钾、镁、铁、磷等，约占菌体成分的 6。,营养与发育,结核菌是需氧菌，但在含有比较低氧的环境下也能生存，
7、比如骨结核，淋巴结核。在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。结核菌生长的适宜温度和人体相近为370C结核菌生长所必需的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。,结核分枝杆菌形态,结核菌是兼性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；形状：0.3 - 0.61 - 4微米的细长杆状，直或稍弯，镜下常堆积成团、成束、排列杂乱无章，也有呈串珠样、链状、索状者。革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。,抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密
8、切，若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度过高）、结核菌的异型相（如：L-型菌、干酪或脓液中的结核菌）可能失去抗酸性。,抗 酸 性,生 长 特 性,生长适宜温度37C，PH6.8-7.2。营养要求较高。在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10多小时，根据接种菌量的多少，一般10-30天肉眼可见菌落生长。,结核病的诊断 诊断发展阶段：经验性、X线影像，細菌学诊断、免疫学（细胞、体液）诊断、分子生物学诊断。 控制结核病的流行，诊断是所有措施中最为关键的一
9、步。,实验室检查,结核病实验室检查包括细菌学检查以及近年来在分子生物学和免疫学等领域建立的检测新技术。细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。检测新技术为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来新的希望。,结核病细菌学诊断,结核病细菌实验室布局原则,1、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用，最好为P3级实验室；2、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行；3、基层只从事涂片镜检的实验室只拥有一间独立房舍的情况下，相对洁净区（镜检区、登记区）与污染区（涂片、染色区）要有明显区分。,基层镜实验室布局范例,
10、染色池,收集标本用的桌子,工作台,采光用窗户（固定）,实验室门,试剂柜,显微镜,记录用的桌子,可以开关的窗户,废弃标本和污染物的处理,废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽灭菌后方能丢弃或清洗；如需焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底或暴露焚烧是危险的；专业化处理试验操作工作面应以3%石炭酸或其他可靠的消毒液擦拭，再用紫外线灭菌灯照射2小时,主要方法,1、痰涂片抗酸染色、镜检技术2、分枝杆菌分离培养技术3、分枝杆菌快速培养技术4、药物敏感性实验技术5、分枝杆菌菌种鉴定技术,痰标本采集 (一),容器：采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4 c
11、m，高度2 cm）。容器上应清晰标注患者姓名、病例号、检查项目。,痰标本采集 (二),按采集的时间，可将标本分为三类 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液； 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液；,合格的痰标本：应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。包括干酪痰、粘液痰和血痰。,对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本性状、质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。,痰标本采集 (三),如何正确留痰,查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。
12、如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。 送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下列要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取12口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。正确的咳痰方法： 1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。 2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。 3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。 4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。 5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。* 注意：部分人如果忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气，
13、争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。,患者留取的痰标本，应由检验人员或经过培训的专人目视检查标本性状质量(特别是用于初次诊断的痰标本)：标本量一般在35 ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；唾液为不合格标本。 确定诊断检查时痰标本不合格者，医务人员应予以进一步指导并要求其重新送检。 进行AFB涂片检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。,痰标本采集 (四),痰标本采集 (五),注意：由
14、于当患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。,1、干酪痰：标本外观以黄色(或奶酪色)、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。,痰标本性状 (一),痰标本性状 (二),2、血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血
15、细胞。由于含血标本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。,3、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞(细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛)，伴有少量肺上皮脱落细胞(多数形态不规则、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于 1:3)、脓性炎症细胞(卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比低于 1:1)、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。,痰标本性状 (三),痰标本性状 (四),4、唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半
16、透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞(形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于 1:2)和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。 由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。,抗酸染色原理,分枝杆菌等抗酸菌菌体成分含脂类物质较多(如：结核分枝杆菌，细菌菌体干重的60是脂类成分) ，且细胞壁结构较复杂。分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸在苯酚的渗透性助染作用下，与首染染料(如复红) 结合牢固，能够耐受酸性酒精的脱色；因而抗酸菌可以保持首染染料的颜色。与之相反，非抗酸菌和绝大多数人体细胞由于细胞结构和菌体
17、成分的限制，在首染染料染色后，容易被酸性酒精脱色，经复染后成为复染染料的颜色。,细菌学常规检查 直接涂片法,操作流程,涂痰膜自然干燥,复红加热初染5分钟,自然干燥镜检,流水冲洗,美兰复染30秒,盐酸酒精脱色,流水冲洗,流水冲洗,细菌学常规检查 直接涂片法,显微镜检报告方式：0条/300视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阴性1-8条/300视野：实报菌数3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（+）1-9条/10视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（2+）1-9条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（3+）10条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（4+）,（一）为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触玻片上的痰膜
18、。（二）仔细观察300以上的视野。（三）每个工作日，一名镜检人员的玻片阅读量一般不应超过25张。（四）连续阅读1012张玻片后，应休息20分钟左右。,镜检读片,痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率 检出菌数 每毫升标本估算菌数 阳性结果机率0/100或更多视野 1000 101-2/300视野 5000 - 10000 501-9/100视野 约30000 801-9/10视野 约50000 90（cv）1-9/每视野 约100000 96.2（cv）10或更多/每视野 约500000 99.95（cv）,查痰次数与阳性机率关系为什么诊断前强调三涂两培（3S 2C） 1 2 3 4 5,细菌学常规检
19、查 直接涂片法,注意事项：选择痰标本中脓性、干酪样的部分涂片阳性率较高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打开痰盒、涂抹痰膜、烧灼接种环时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须加温。,细菌学常规检查 直接涂片法,优点：是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时可报告结果。,细菌学常规检查 直接涂片法,缺点：敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结
20、果；特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不能区分结核和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。,涂片镜检质量保证系统 室内质控,标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告和登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室的统一标准严格进行操作。复查方式：自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。互查：由本实验室其他试验员抽查当日10% 涂片。,涂片镜检质量保证系统室间质控,全国质控系统：以参比实验室工作网为基础，以逐级督导为基本模式，以现场和非现场督导为主要方式。现场督导：上级实验室人员赴基层实验室就实验室布局、安全防护、污染物处理、涂片染色操作、显微镜
21、维护状况、日常实验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片复查。非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原则抽取涂片交实验室复查。,一、实验室现场评估,（一）目的：实验室现场评估是相应实验室各项条件的调查总结和质量提高的基本手段之一。建立相关实验室技术档案：由被督导实验室填写结核病实验室基本情况登记表，每次现场评价时需重新核实登记内容。调查相关实验室QA措施的制度和执行情况；调查相关实验室设备状态及安全防护情况；调查操作人员对相关检查程序的认知和掌握程度；调查相关实验室影响AFB检查质量的因素并提出相应质量提高措施、督导改正。,结核病实验室基本情况登记表,单 位 名称： 实验室名称： 主
22、任 姓名： 电话： 手机： 单 位 地址： 邮 编： 传真： E-mail： 1.结核病实验室技术人员登记,2.上一年实验室工作量统计：,现场评估调查程序 1.试剂,如有填写“否”的项目，请简要说明原因：,2. 耗材保障,3、实验室安全防护,如有填写“否”的项目，请简要说明原因：所有痰检室仅一间，且做其它检验项目；操作时未戴防护手套；蔡甸区无上下水,4、显微镜,如有填写“否”的项目，请简要说明原因：,5、用于EQA的玻片保存情况,6、玻片、染色和镜检,7、现场复检 A. 现场评价时督导员至少要随机抽查3张阳性玻片,AFB()玻片质量评估图例(1),涂抹较厚 (AFB),复红染色不充分镜下表现,
23、AFB菌体着色浅；AFB菌体异染颗粒不明显；较规范染色菌体细；,AFB()玻片质量评估图例(2),脱色不充分镜下表现(1),AFB菌体异染颗粒不明显复染背景无法展现背景细胞复染后显色较深(呈棕/黑色),AFB()玻片质量评估图例(3),脱色不充分镜下表现(2),菌体颜色不同；易造成非抗酸菌的“抗酸性”；,AFB()玻片质量评估图例(3),脱色不充分镜下表现(3),血痰中白细胞核出现“抗酸性”；为避免假阳性结果，建议血痰标本必须进行重复脱色！,AFB()玻片质量评估图例(4),脱色时间过长镜下表现,AFB颜色呈桔黄色AFB菌体/细胞与背景界线不明显复染着色度下降,AFB()玻片质量评估图例(5)
24、,复染时间过长镜下表现,背景着色较深 AFB菌体颜色被遮盖,AFB()玻片质量评估图例(6),复检样本量计算表,复检样本量计算表说明：,a、玻片阳性率：指所有检测的玻片中阳性玻片的比例（平均阳性率）。b、上一年阴性玻片总数：每年玻片的总数减去全年阳性玻片数。c、抽样时，当上一年阴性玻片数量和玻片阳性率不在选择点，阴性玻片数值采用区间上限，玻片阳性率采用区间下限。,复检结果评价,盲法复检的目的不是为了验证某个病人诊断正确与否,而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了玻片镜检结果存在的误差之外，还包括检查标本的质量（合格标本与不合格标本的比例）、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等,以便采取纠正措施
25、，提高实验室的工作质量。,1.误差分类：分为定性误差和定量误差（1）定性误差包括高假阳性和高假阴性高假阳性（High False Positive HFP）：阴性片被错误地判读为2以上的阳性。高假阴性（High False Negative HFN）：2以上的阳性玻片被错误地判读为阴性。,（2）定量误差包括量化误差、低假阳性和低假阴性量化误差（Quantification Error ，QE）：同一张阳性玻片初检者和复检者阳性判断级别的差异。低假阳性（Low False Positive ，LFP）：阴性玻片被错误地判断为1及以下的阳性。低假阴性（Low False Negative ， LFN）：1及以下玻片被错误地判断为阴性。,常见“误差”原因,批量测试,批量测试是指定期地由国家或省级参比室向外周实验室发送已经染色和(或)未染色的玻片，由外周实验室人员来读片并对读片结果进行评估。这种方法是检查实验室技术人员的染色能力和(或)读片能力，主要检测个人的操作技术，而不是检测实验室的整体操作水平，也不是检测实验室的常规操作。当没有其它质量评价方法存在时，批量测试可以作为部分评价当前操作技术的有价值的测量方法。,结核病的细菌学检验始终要细心、用心，强调标准化和规范化，要做好实验的每一个细节和每一张涂片。,谢 谢 ！,
